體外誘導(dǎo)人臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化過程中APJ表達(dá)變化

曹芳英，張寧坤，高連如，朱智明

·心血管疾病與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)·

體外誘導(dǎo)人臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化過程中APJ表達(dá)變化

曹芳英，張寧坤，高連如，朱智明

目的研究人臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord Wharton′s Jelly-mesenchymal stem cells，HUW-MSCs）體外誘導(dǎo)向內(nèi)皮細(xì)胞分化過程中表面APJ受體表達(dá)的變化，探討APJ是否可作為鑒定內(nèi)皮細(xì)胞的早期細(xì)胞表面標(biāo)志物。方法剖宮產(chǎn)取臍帶后分別用酶消化和組織貼壁法培養(yǎng)獲得臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞，用酶消化法獲得人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）。取2×107第2代HUW-MSCs用單克隆APJ-APC熒光抗體標(biāo)志后行流式分選，測(cè)定HUW-MSCs實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞表面表達(dá)APJ的水平。實(shí)驗(yàn)分3組：誘導(dǎo)組MSCs用含血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子5μg／L、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10μg／L、表皮生長(zhǎng)因子10μg／L和10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）M199培養(yǎng)基培養(yǎng)；共同培養(yǎng)組MSCs先與HUVECs在Transwell 6孔培養(yǎng)板中，用含10%FBS的M199培養(yǎng)5～7 d后轉(zhuǎn)入25 cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%FBS的M199和培養(yǎng)1 d內(nèi)皮細(xì)胞的M199（2∶1）混合培養(yǎng)基；單純培養(yǎng)組細(xì)胞培養(yǎng)基為含10% FBS的M199。培養(yǎng)周期為14 d。分別于第7、10、14天流式檢測(cè)各組細(xì)胞APJ表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞表面APJ水平作為陽性對(duì)照。另外于第7、14天檢測(cè)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組、內(nèi)皮細(xì)胞組、HUW-MSCs組內(nèi)皮細(xì)胞早期標(biāo)志物CD309表達(dá)變化情況，比較各實(shí)驗(yàn)組之間APJ與CD309變化趨勢(shì)。結(jié)果HUW-MSCs流式分選出5× 103APJ＋-HUW-MSCs，表面表達(dá)APJ基本呈陰性。誘導(dǎo)組、共同培養(yǎng)組和單純培養(yǎng)組細(xì)胞形態(tài)均較HUWMSCs有顯著改變，誘導(dǎo)組呈圓形、線性、網(wǎng)狀，共同培養(yǎng)、單純培養(yǎng)組細(xì)胞呈卵圓形、長(zhǎng)梭形。另外，誘導(dǎo)組生長(zhǎng)最快，增殖能力最強(qiáng)；單純培養(yǎng)組次之；共同培養(yǎng)組細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，增殖能力最弱。第7、10、14天，3組細(xì)胞CD309表達(dá)分別為誘導(dǎo)組1.8%、2.6%和8.8%，共培養(yǎng)組0.5%、2.5%和4.7%，單純培養(yǎng)組0.3%、2.1%和2.7%。第7、10、14天各組APJ陽性表達(dá)率分別為誘導(dǎo)組0.5%、0.9%和5.2%，共培養(yǎng)組0.4%、0.8%和3.0%，單純培養(yǎng)組0.2%、0.6%和2.1%。結(jié)論HUW-MSCs表面APJ表達(dá)基本呈陰性，HUW-MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中APJ表達(dá)逐漸上調(diào)，與內(nèi)皮細(xì)胞早期標(biāo)志物CD309變化趨勢(shì)基本一致，可作為早期內(nèi)皮細(xì)胞鑒定的標(biāo)志物。

臍帶華通膠；間充質(zhì)干細(xì)胞；血管內(nèi)皮細(xì)胞；APJ受體；細(xì)胞標(biāo)志物

1993年O′Dowd發(fā)現(xiàn)了7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體APJ，由位于11號(hào)染色體q12基因編碼。APJ的內(nèi)源性配體是Apelin，Apelin／APJ系統(tǒng)與腎素-血管緊張素系統(tǒng)存在高度的交互作用，在心血管系統(tǒng)中主要起正性變力、血容量和血壓調(diào)節(jié)作用。1996年研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞和胚胎中的脈管系統(tǒng)前體細(xì)胞表達(dá)APJ。近期，Vodyanik等［1］研究人胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為中胚層細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)中胚層中存在表達(dá)APJ陽性的細(xì)胞，他們稱為間質(zhì)成血管細(xì)胞（mesenchymoangioblast），是間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞共同的前體細(xì)胞。本文研究體外經(jīng)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）及表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）等細(xì)胞因子和內(nèi)皮細(xì)胞非接觸共同培養(yǎng)兩種方法，定向誘導(dǎo)HUW-MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化，觀察誘導(dǎo)過程中細(xì)胞表面APJ受體表達(dá)的變化，探討APJ是否可作為內(nèi)皮細(xì)胞的早期鑒定的細(xì)胞表面標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM）、M199培養(yǎng)液、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）美國Gibco公司，VEGF、bFGF、EGF美國PeproTech公司，APJ-APC美國R＆D公司，CD309-澡紅蛋白（phycoerythrin，PE）美國BD公司，Dil標(biāo)記乙?；兔芏戎鞍祝―il-labeled acetylated low density lipoprotein，DIL-Ac-LDL）美國Invitrogen公司，血管假性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）武漢博士德生物公司，Transwell美國Corning公司，CO2培養(yǎng)箱美國Thermo公司，倒置顯微鏡日本Olympus公司，流式細(xì)胞儀美國BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HUW-MSCs的分離與培養(yǎng) 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及孕婦知情同意后，取無菌新鮮的足月剖宮產(chǎn)健康胎兒臍帶。用磷酸鹽緩沖液（phosphate saline buffer，PBS）洗凈血污后剪成數(shù)段，沿臍靜脈剪開后剔除臍靜脈和臍動(dòng)脈，剝離華通膠，用組織剪將無菌培養(yǎng)皿中華通膠剪碎成1 mm×1 mm×1 mm及以下組織塊，分別轉(zhuǎn)入75 cm2的培養(yǎng)瓶和50 ml離心管中。培養(yǎng)瓶中加入10 mL含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）及1%青、鏈霉素的DMEM后置37℃，5%CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。離心管中加入Ⅱ型膠原酶浸沒華通膠組織后，置于37℃水浴箱消化12 h，待華通膠消化完全后，向消化液加入含20%FBS的DMEM（體積比1∶4）后分裝于75 cm2的培養(yǎng)瓶中后置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待貼壁法和消化法培養(yǎng)瓶中開始出現(xiàn)細(xì)胞后首次半量換液，以后每3～4 d換液處理，細(xì)胞融合至90%左右傳代。

1.2.2 HUVECs的分離、培養(yǎng)與鑒定 將剝離的臍靜脈放入15 mL離心管中，加入0.25%胰酶浸沒組織后置于37℃水浴箱中消化13min，加入1mL FBS終止消化，收集消化液1 500 r／min×10 min離心，棄上清，加入含有10 mL 10%FBS及1%青、鏈霉素的M199培養(yǎng)液混勻，移入25 cm2的培養(yǎng)瓶中后置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4 d換液處理，細(xì)胞融合至90%左右傳代。取第2代細(xì)胞消化離心，用PBS重懸后，以每管體積100μL分裝于3個(gè)15 mL離心管中，其中1、2管分別加入10μL CD309-PE和APJAPC等熒光抗體后孵育30min，第3管為對(duì)照組，將各組細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。同時(shí)，將細(xì)胞分別接種于24孔板和96孔板，待細(xì)胞貼壁24 h，向24孔板中加入10μg／mL DIL-ac-LDL培養(yǎng)24 h后倒置熒光下觀察細(xì)胞攝取DIL-ac-LDL情況。96孔板細(xì)胞按照免疫組化試劑盒步驟檢測(cè)vWF。

1.2.3 HUW-MSCs分選與分組培養(yǎng) 取2×107第2代HUW-MSCs與APJ-APC抗體用1.2.2同樣方法孵育后進(jìn)行流式細(xì)胞分選APJ＋-HUW-MSCs。重新取第2代HUW-MSCs分為3組，誘導(dǎo)組、共培養(yǎng)組和單純培養(yǎng)組。誘導(dǎo)組細(xì)胞用含有VEGF 5μg／L、β-FGF 10μg／L、EGF 10μg／L和10%FBS＋1%青、鏈霉素M199培養(yǎng)液培養(yǎng)，共培養(yǎng)組為HUW-MSCs與HUVEC于Transwell中非接觸共同培養(yǎng)5～7 d轉(zhuǎn)入25 cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)以HUVECs培養(yǎng)基與10% FBS＋1%青、鏈霉素M199混合液（1∶2）培養(yǎng)。單純培養(yǎng)組細(xì)胞以10%FBS＋1%青、鏈霉素M199培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各亞組細(xì)胞APJ表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)至第7、10、14天消化誘導(dǎo)組、共培養(yǎng)組、單純培養(yǎng)組及HUW-MSCs組細(xì)胞后制成細(xì)胞懸液，分別加入10μL APJ-APC及CD309-PE抗體孵育，然后流式細(xì)胞儀檢測(cè)4組細(xì)胞APJ及CD309的表達(dá)情況。流式細(xì)胞儀檢測(cè)前的細(xì)胞處理同1.2.2。

2 結(jié)果

2.1 HUW-MSCs培養(yǎng)與觀察 采用貼壁法培養(yǎng)的HUW-MSCs細(xì)胞一般7～10 d在組織塊周圍可見有爬出；消化法培養(yǎng)的細(xì)胞出現(xiàn)略早，5 d左右可在培養(yǎng)瓶底觀察到細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。顯微鏡觀察兩種方法培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)一致，均為短梭形（圖1a），呈克隆樣生長(zhǎng)，3～5 d后細(xì)胞迅速融合。原代細(xì)胞消化傳代后生長(zhǎng)加快，每3 d左右可傳代。HUW-MSCs擴(kuò)增到第2代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定。

2.2 HUVECs鑒定 顯微鏡下觀察HUVECs細(xì)胞呈橢圓形或多角形，呈鋪路石樣排列（圖1b）。HUVECs攝取DIL-ac-LDL，顯微鏡下觀察到紅色熒光（圖1c），vWF免疫組化（圖1d）結(jié)果呈陽性。流式檢測(cè)CD309和CD31表達(dá)率分別為1.8%和1.0%（圖2）。

2.3 HUW-MSCs、HUVECs、誘導(dǎo)組、共培養(yǎng)組和單純培養(yǎng)組細(xì)胞流式檢測(cè)CD309 流式檢測(cè)HUWMSCs和HUVECs表面CD309表達(dá)率分別為0.2%和1.8%（圖3）。第7、10、14天3個(gè)實(shí)驗(yàn)組CD309的表達(dá)率逐漸上調(diào)，誘導(dǎo)組分別為1.8%、2.6%和8.8%，共同培養(yǎng)組為0.5%、2.5%和4.7%，單純培養(yǎng)組分別為0.3%、2.1%和2.7%（圖4）。

2.4 HUW-MSCs、HUVECs、誘導(dǎo)組、共培養(yǎng)組和單純培養(yǎng)組細(xì)胞流式檢測(cè)APJ HUW-MSCs表面APJ表達(dá)極低，2×107第2代HUW-MSCs經(jīng)流式分選出5×103，表達(dá)基本呈陰性。APJ受體在HUVECs表達(dá)較HUW-MSCs高，表達(dá)率為0.7%（圖5）。誘導(dǎo)組、共培養(yǎng)和單純培養(yǎng)組細(xì)胞于第7、10、14天流式檢測(cè)APJ表達(dá)，結(jié)果顯示各組細(xì)胞APJ表達(dá)均呈上調(diào)趨勢(shì)；其中誘導(dǎo)組分別為0.5%、0.9%和5.2%，共培養(yǎng)組分別為0.4%、0.8%和3.0%，單純培養(yǎng)組分別為0.2%、0.6%和2.1%（圖6）。3組表達(dá)APJ及CD309變化趨勢(shì)見圖7。

圖1 HUW-MSCs細(xì)胞培養(yǎng)和HUVECs鑒定

圖2 HUVECs表面CD309和CD31表達(dá)率

圖3 HUW-MSCs和HUVECs表面CD309表達(dá)率

圖4 3組CD309的表達(dá)率

圖5 HUVECs和HUW-MSCs表面APJ表達(dá)率

圖6 3組細(xì)胞APJ表達(dá)率

圖7 3組細(xì)胞表面表達(dá)CD309和APJ的變化趨勢(shì)

3 討論

APJ是7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，跨膜區(qū)氨基酸序列與血管緊張素Ⅰ受體有54%的同源性；但不結(jié)合血管緊張素Ⅱ，兩者在心血管系統(tǒng)解剖分布中存在重疊，因此又稱為Apelin受體。人和鼠的APJ氨基酸序列的同源性達(dá)74%。Apelin是APJ目前已發(fā)現(xiàn)的唯一天然配體，廣泛存在于乳腺、肺、腦、脂肪和心臟等多個(gè)組織中，有Apelin-13、Apelin-17和Apelin-36等亞型。APJ與Apelin的分布不完全一致，主要在血管內(nèi)皮、心肌、血管平滑肌及脂肪組織，目前尚未發(fā)現(xiàn)APJ有亞型。Apelin／APJ系統(tǒng)的生理功能尚不明確。在循環(huán)系統(tǒng)，Apelin／APJ系統(tǒng)主要通過血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞發(fā)揮血壓和血容量調(diào)節(jié)的作用，在血管發(fā)生、抑制內(nèi)皮凋亡和平滑肌細(xì)胞增殖過程中也起重要作用，并與動(dòng)脈粥樣硬化過程有關(guān)［2-3］。Gao等［4］認(rèn)為Apelin／APJ系統(tǒng)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后與心肌再生和功能修復(fù)過程有關(guān)。在機(jī)體內(nèi)，容量、壓力負(fù)荷和血管緊張素Ⅱ均可調(diào)節(jié)APJ的表達(dá)［5］。Sheikh等［6］研究顯示，心血管疾病患者心臟和血管組織中APJ表達(dá)水平顯著下調(diào)，而低氧刺激能夠誘導(dǎo)缺血性心力衰竭的小鼠心肌細(xì)胞APJ表達(dá)上調(diào)。

間充質(zhì)干細(xì)胞是中胚層來源的多能干細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)HUW-MSCs表面APJ的表達(dá)接近于陰性，而既往文獻(xiàn)報(bào)道骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中APJ表達(dá)陽性［4，7］。我們推測(cè)造成這種結(jié)果的原因可能有：①臍帶華通膠間充質(zhì)中由中胚層中間質(zhì)成血管細(xì)胞分化而來的干細(xì)胞數(shù)量極其稀少；②既往研究細(xì)胞APJ表達(dá)主要采用免疫組化，而本實(shí)驗(yàn)中采用的是APJ單克隆熒光抗體，兩種檢測(cè)方法的結(jié)果可能存在一定差異。臍靜脈內(nèi)皮是大血管內(nèi)皮細(xì)胞，是目前體外研究最常用的人內(nèi)皮細(xì)胞，在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)APJ，但陽性率不高。這與Kleinz等［8］研究顯示在HUVECs的整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中APJ-LI表達(dá)水平很低，而在靠近細(xì)胞核膜的細(xì)胞器中的APJ-LI稍高結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅰ刺激HUVECs后其APJ表達(dá)上調(diào)［9］。既往文獻(xiàn)報(bào)道在成人的整個(gè)脈管系統(tǒng)中的內(nèi)皮細(xì)胞始終表達(dá)與APJ受體一致，但在脈管系統(tǒng)發(fā)育的早期階段，內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮前體細(xì)胞的APJ表達(dá)非常受限，而在新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)較高。目前還發(fā)現(xiàn)在腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞中APJ表達(dá)明顯提高［10］。對(duì)鋸齒類和兩棲類動(dòng)物的胚胎發(fā)育的研究顯示：在胚胎早期，APJ于發(fā)育來源為背主動(dòng)脈（dorsal aorta）的新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，而在已存在的背主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中APJ不表達(dá)［9］；內(nèi)皮前體細(xì)胞和新生的血管結(jié)構(gòu)中APJ表達(dá)水平較高，但隨著機(jī)體的發(fā)育成熟，APJ逐漸消失［9］。CD309又稱Flk-1、KDR，是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-2。文獻(xiàn)報(bào)道在干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化第7天表達(dá)CD309，可作為內(nèi)皮細(xì)胞分化的早期標(biāo)志物［11］。本研究中，發(fā)現(xiàn)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞表面APJ和CD309表達(dá)均上調(diào)。3組APJ表達(dá)于第10天左右APJ檢測(cè)與HUVECs陽性率相當(dāng)，且3組CD309在第7～10天之間達(dá)到HUVECs表達(dá)水平。但受實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)所限，未能進(jìn)行大量重復(fù)實(shí)驗(yàn)，比較各組間不同時(shí)期APJ陽性表達(dá)差異。因此，我們推測(cè)APJ和CD309一樣，可作為內(nèi)皮細(xì)胞早期的表面標(biāo)志物。

另外，我們觀察到采用M199培養(yǎng)液培養(yǎng)的MSCs，其形態(tài)和增殖能力較DMEM培養(yǎng)的細(xì)胞有顯著變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)其APJ表達(dá)陽性率提高。這與Saleh等［12］報(bào)道的內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基顯著影響MSCs的生物學(xué)行為相符。有研究者用基礎(chǔ)培養(yǎng)基（CR2）和完全培養(yǎng)基（M199）分別培養(yǎng)生殖細(xì)胞，結(jié)果顯示兩者對(duì)細(xì)胞分裂影響的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此認(rèn)為不是所有完全培養(yǎng)基中的化學(xué)組分是細(xì)胞分裂所必需的［13］。同時(shí)，該研究顯示血清或血清衍生物比基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的化學(xué)組分對(duì)細(xì)胞的影響更大，而血清的影響主要是其包含的生長(zhǎng)因子起作用［13］。Lutolf等［14］則認(rèn)為外部因素包括細(xì)胞外基質(zhì)成分、機(jī)械刺激，氧濃度、營養(yǎng)擴(kuò)散及臨近細(xì)胞分泌的可溶性的調(diào)節(jié)因子均對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)行為有影響。

內(nèi)皮細(xì)胞可通過影響外周環(huán)境調(diào)節(jié)MSCs的行為和分化能力［15］。Lozito等［16］研究顯示大血管和微血管的內(nèi)皮細(xì)胞的基質(zhì)成分明顯不同，與MSCs共培養(yǎng)時(shí)對(duì)MSCs分化的影響作用機(jī)制也不同。HUVEs來源于胚胎組織與成體來源的內(nèi)皮細(xì)胞存在差異［17］。因此，本實(shí)驗(yàn)中采用了MSCs和HUVECs共培養(yǎng)的方法。在MSCs和HUVECs共培養(yǎng)體系中，我們發(fā)現(xiàn)MSCs隨著培養(yǎng)時(shí)間增殖能力顯著下降，這與既往文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致［15］。Saleh等［15］研究還顯示在內(nèi)皮細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞的共同培養(yǎng)體系中內(nèi)皮細(xì)胞能夠調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)行為，例如顯著影響MSCs增殖和成骨、成脂分化過程并促進(jìn)Wnt／BMP信號(hào)系統(tǒng)激活等。另外，Ronkainen等［18］發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞能表達(dá)Apelin。因此，我們推測(cè)共同培養(yǎng)組較單純培養(yǎng)組APJ陽性細(xì)胞百分率更高的原因可能與HUVECs分泌Apelin或VEGF等細(xì)胞因子有關(guān)。

間充質(zhì)干細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞的特性，使用VEGF、β-FGF、IGF及EGF等細(xì)胞因子可將MSCs成功誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。VEGF能激活酪氨酸激酶受體，特異性地促進(jìn)細(xì)胞分裂；在許多病理生理狀態(tài)下，VEGF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞等過程中起主要作用［7］。β-FGF創(chuàng)造了促進(jìn)MSCs向血管內(nèi)皮樣細(xì)胞分化的微環(huán)境；EGF可刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)中采用VEGF、β-FGF及EGF 3種細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)MSCs后發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)組細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂能力增強(qiáng)伴細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，同時(shí)APJ表達(dá)上調(diào)且幅度較共培養(yǎng)及單純培養(yǎng)組更加顯著。Kidoya等［9］研究也顯示VEGF、β-FGF在體外均能上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞APJ和Apelin的表達(dá)；同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)在VEGF的作用下，Apelin具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和細(xì)胞與細(xì)胞之間的聚集作用［9］，但Apelin促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖的效應(yīng)不是通過上調(diào)VEGF或FGF等生長(zhǎng)因子表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的［19］。

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·資 訊·

每日服用阿司匹林可降低卵巢癌風(fēng)險(xiǎn)

美國國家癌癥研究所一項(xiàng)新研究顯示，每天服用阿司匹林女性罹患卵巢癌風(fēng)險(xiǎn)可以降低20%。卵巢癌是女性健康的一大威脅，每年僅美國就有逾2萬例確診患卵巢癌，1.4萬名女性死于這種疾病。早期卵巢癌可成功治療，但早期卵巢癌癥狀與消化系統(tǒng)疾病和膀胱疾病類似，因此卵巢癌常常到晚期才被發(fā)現(xiàn)。

阿司匹林具有抗炎癥的效果，之前研究顯示每日服用阿司匹林能夠降低罹患結(jié)腸直腸癌、黑色素瘤等癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，因而開展了迄今最大型的研究來評(píng)估阿司匹林與卵巢癌風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系。

研究人員分析了來自約8 000例卵巢癌患者和近1.2萬名未罹患卵巢癌女性的數(shù)據(jù)，這些人中有18%經(jīng)常服用阿司匹林。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與每周服用阿司匹林不到1次的女性相比，每天服用阿司匹林的女性患卵巢癌風(fēng)險(xiǎn)降低了20%。其機(jī)制可能通過誘導(dǎo)凋亡、抑制血管生成及增加細(xì)胞免疫發(fā)揮作用。相關(guān)論文發(fā)表在Journal of the National Cancer Institute雜志上。研究表明，阿司匹林也可以降低卵巢癌風(fēng)險(xiǎn)，但這一結(jié)果不應(yīng)影響當(dāng)前的臨床實(shí)踐，還需要更多的研究以探索這種潛在防癌藥物的風(fēng)險(xiǎn)與益處的平衡。

（摘自：Tsoref D，Panzarella T，Oza A.Aspirin in prevention of ovarian cancer：arewe at the tipping point？［J］.JNatl Cancer Inst，2014，106（2）：djt453. 編輯部）

Expression and variance of APJ in umbilical cord-derived hum an mesenchymal stem cells induced into endothelial cell in vitro

CAO Fangying1，2，ZHANG Ningkun2，GAO Lianru2，ZHU Zhiming2
（1.Department of Reseach，Southern Medical University，Guangzhou Guangdong 510515，China；2.Heart Center，Navy General Hospital，Beijing 100048，China）

ObjectiveTo explone the expression and variation，induced by cytokines in vitro，of APJ inmesenchymal stem cells from human umbilical cord Wharton′s Jelly.To identify APJ is whether a surface mark of vascular endothelial cell or not in prophase of differentiation.MethodsThe umbilical cord was obtained from cesarean section.We isolated the Wharton′s Jelly and umbilical veins endothelial cells and cultured the adherent cells.Cells labeled with monoclonal fluorescent antibody reaching up to 2×107of P2 generation were undergone sorting through flow cytometer.Cells were divided into 3 subgroups，induction，coculture and haplo-cultivation.The concentration ofVEGF，β-FGF and EGF in culture media，M199，for induction subgroup was 5μg／L，10μg／L，10 μg／L respectively.MSCs were first cocultured with HUVEC in non-contact system by Trans well for 5－7 days，then we fed them withmixed M199making up with fresh media and suction from endotheliocyte in volume ratio of 1∶2 in common culture flask.All of the M199 contained 10%FBS and 1% mycillin.The whole cultivation cycle was fortnight，and we checked out the APJ in 3 subgroups in d7，d10 and d14 and CD309 in d7，d10 and d14 respectively.ResultsAbout five thousands of APJ＋-HUW-MSCswas obtained after sorting.Morphous of cells in 3 subgroups had changed dramatically compared to MSCs cultured by EMEM／F12，which presented shapes as follow round，filate and reticulum cells in induction group，oval and elongated fusiform cellswere coculture and haplo-cultivation.As for reproductive activity，the most was induction，the weakest was coculture.Expression of CD309 in d7，d10 and d14 of the induction，coculture and haplo-cultivation were（1.8%vs.2.6% vs.8.8%），（0.5%vs.2.5%vs.4.7%）and（0.3%vs.2.1%vs.2.7%）respectively.The percentage of APJpositive cells in induction were（0.5%vs.0.9%vs.5.2%）in d7，d10 and d14，（0.4%vs.0.8%vs.3.0%）respectively with coculture.In haplo-cultivation，they were（0.2%vs. 0.6%vs.2.1%）.ConclusionExpression of receptor APJ in the surface of MSCs is approaching to negative.In the induction of HUW-MSCs into vascular endothelial cells，APJexpression enhance gradually in accordance with CD309，a pristine mark of vascular endothelial cells，and APJmay be a new mark of identification of vascular endothelial cells in prophase of differentiation.

Wharton′s Jelly；Mesenchyma stem cells；Vascular endothelial cell；APJ receptor；Surface mark

R329.2＋4；Q254

A

2095-3097（2014）01-0031-06

10.3969／j.issn.2095-3097.2014.01.008

2013-03-13 本文編輯：徐海琴）

海軍總醫(yī)院創(chuàng)新培育基金（CX201101）

510515廣東廣州，南方醫(yī)科大學(xué)研究生部（曹芳英）；100048北京，海軍總醫(yī)院心臟中心（曹芳英，張寧坤，高連如，朱智明）

朱智明，E-mail：zhuzhiming6542＠sina.com