96 孔板氯霉素分子印跡膜的制備

杜幸潔，張峰，張慧曉，文永佳，薩仁托雅

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一廣譜抗生素，對(duì)革蘭陽(yáng)性、陰性細(xì)菌均有抑制作用，但對(duì)陰性細(xì)菌的作用較強(qiáng)。由于氯霉素價(jià)格低廉、抗菌效果佳、藥性穩(wěn)定，在生產(chǎn)實(shí)踐中常被作為飼料添加劑，用于預(yù)防、治療細(xì)菌性疾病。然而CAP 對(duì)人體具有嚴(yán)重的毒副作用，它能抑制人體骨髓造血機(jī)能，導(dǎo)致各類血細(xì)胞減少，尤其是白細(xì)胞，而且它還容易引起人體再生障礙性貧血等，因此，CAP的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)在歐盟、美國(guó)等有關(guān)法規(guī)中規(guī)定為“零容許量”。中國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定CAP 及其鹽、脂等在食品動(dòng)物的所有可食組織中不得檢出［1］。

分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technology，MIT)，又稱為分子烙印技術(shù)，對(duì)其理論基礎(chǔ)的研究主要有Fischer［2］的酶與底物作用的“鎖與鑰匙模型”、Pauling［3］早期提出的抗體形成學(xué)說(shuō)和Dickey［4］的“專一性吸附理論”。分子印跡技術(shù)是以待測(cè)物或其結(jié)構(gòu)類似物為模板分子，模擬自然界所存在的分子識(shí)別原理(如酶與底物、抗體與抗原等特異性識(shí)別)，合成具有專一識(shí)別功能的分子印跡聚合物(molecular imprinting polymers，MIP)的一種技術(shù)［5］。分子印跡聚合物因其制備簡(jiǎn)單，能專一識(shí)別目標(biāo)分子，而且具有穩(wěn)定性高、能重復(fù)使用、抗惡劣環(huán)境能力強(qiáng)(如抗酸、抗堿、抗高溫)等特點(diǎn)而被越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于很多領(lǐng)域。目前，所報(bào)道的氯霉素分子印跡膜大多是以電極［6-7］、濾膜［8］為支撐體合成的，主要被用于生物傳感器［6-7］等，而以96 孔板為支撐體合成氯霉素分子印跡膜被用作人工抗體的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究中采用本體聚合法，以氯霉素為模板分子，四氫呋喃為致孔劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，采用紫外燈引發(fā)聚合，在96 孔板上合成氯霉素分子印跡聚合膜，并且通過(guò)試驗(yàn)優(yōu)化了該分子印跡膜的制備方法，為下一步用該膜代替氯霉素的生物抗體，采用直接競(jìng)爭(zhēng)原理，合成酶標(biāo)氯霉素，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光免疫法［9-10］檢測(cè)氯霉素奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑:氯霉素(CAP，98%)、甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯(DEAEM，99%)、四氫呋喃(THF，99%)、偶氮二異丁腈(AIBN，99%)、甲砜霉素(TAP，99.5%)、氟甲砜霉素(FF，98%)、甲基丙烯酸(MAA，99%)、4-乙烯基吡啶(4-VP，99%)均購(gòu)自阿拉丁試劑公司;乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，98%)購(gòu)自Sigma公司;甲醇、乙酸均購(gòu)自上海生工生物有限公司;甲醇、乙酸均為分析純。

儀器:Q3200B-型超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)、ZW-A 微量振蕩器(常州澳華儀器有限公司)、HGC-12A 氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)、100 W紫外燈(λ=365 nm，飛利浦進(jìn)口光源有限公司)、高效液相色譜儀(HPLC，大連依利特分析儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 CAP 分子印跡聚合物的合成 稱取80 mg CAP 放入25 mL 圓底燒瓶中，并向瓶中加入5 mL THF，超聲處理5 min;待CAP 溶解后向其中加入200 μL DEAEM，超聲處理20 min;再加入50 μL EGDMA和0.02 g AIBN，超聲處理20 min;超聲處理結(jié)束后，以每孔25 μL 將混合液滴加到96 孔板上，將板放入密封袋中，充入氮?dú)?5 min，密封;將袋置于100 W 紫外燈下照射6 h。聚合反應(yīng)結(jié)束后，用100 mL 甲醇乙酸混合液(二者的體積比為3∶1)超聲洗脫模板分子，每4 h 更換一次洗脫液，用HPLC 檢測(cè)，直至洗脫液中檢測(cè)不到模板分子為止。

非印跡聚合物(NIP)的合成除不加入模板分子CAP 外，其余步驟同上。

1.2.2 聚合物吸附性能的測(cè)定 配制一系列CAP甲醇溶液(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 mg/L)，將其分別以每孔200 μL 滴加到MIP和NIP 中，再將MIP和NIP 置于振蕩器上振蕩80 min，結(jié)束后用HPLC 檢測(cè)各種溶液中CAP 的濃度。每孔吸附量的計(jì)算公式為

其中:CI、CF分別為吸附初始和吸附結(jié)束后CAP甲醇溶液的濃度;V 為加入溶液的體積。

1.2.3 聚合物的吸附動(dòng)力學(xué)曲線及吸附特異性分別配制初始濃度為50 mg/L 的CAP 甲醇、TAP甲醇和FF 甲醇溶液，以每孔200 μL 分別滴加到MIP 96 孔板上，振蕩不同時(shí)間(5、10、20、30、40、50、60、70、80、90 min)，用HPLC 檢測(cè)各種溶液中CAP、TAP和FF 的濃度，擬合得到3種物質(zhì)的動(dòng)吸附力學(xué)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 CAP 96 孔板分子印跡聚合膜制備條件的優(yōu)化

2.1.1 功能單體的選擇 試驗(yàn)中模板分子CAP和交聯(lián)劑EGDMA 的用量固定不變，選擇MAA、4-VP和DEAEM 為功能單體，以合成聚合物的最終吸附性為指標(biāo)，檢驗(yàn)3種功能單體合成聚合物的優(yōu)劣。結(jié)果表明，以DEAEM 為功能單體，合成的CAP 分子印跡膜的吸附速率最快，能在50 min 內(nèi)達(dá)到吸附平衡，而以MAA和4-VP 為功能單體，合成的印跡膜則吸附慢且吸附量少(表1)。所以，本試驗(yàn)中選用DEAEM 為功能單體。

表1 不同功能單體對(duì)分子印跡聚合膜吸附性的影響Tab.1 Influence of the functional monomers on the adsorption on imprinted film

2.1.2 功能單體用量的選擇 試驗(yàn)中模板分子CAP和交聯(lián)劑EGDMA 的用量固定不變，按照CAP與功能單體DEAEM 的摩爾比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5，選用不同用量的DEAEM，制備一系列聚合物，洗脫后測(cè)定其吸附量。從表2可見(jiàn):當(dāng)CAP 與DEAEM 的摩爾比不超過(guò)1∶4 時(shí)，隨著DEAEM 用量的增大，CAP 分子印跡聚合膜對(duì)CAP 的吸附量也隨之增加，可能是隨著功能單體用量的不斷增加，形成的CAP 分子空穴越來(lái)越多，因此聚合膜的吸附量也不斷增加;當(dāng)DEAEM 的用量為1.00 mmol 時(shí)，聚合膜的吸附量達(dá)到最大(1.49 μg/孔);當(dāng)CAP 與DEAEM 的摩爾比超過(guò)1∶4 時(shí)，聚合膜的吸附量反而減小，可能是因?yàn)楣δ軉误w過(guò)多時(shí)發(fā)生自體聚合，影響了CAP 分子空穴的形成，導(dǎo)致聚合膜的吸附量減少。所以，本試驗(yàn)中選用模板分子CAP 與功能單體DEAEM 的摩爾比為1∶4。

2.1.3 溶劑的選擇 溶劑不僅給每個(gè)反應(yīng)物質(zhì)提供了一個(gè)良好的聚合反應(yīng)環(huán)境，而且在聚合物形成過(guò)程中還充當(dāng)著致孔劑的作用。常用于聚合反應(yīng)的有機(jī)溶劑有THF、乙醇、乙腈等。本試驗(yàn)結(jié)果表明，利用乙醇和乙腈作為溶劑在96 孔板上合成的聚合物均不規(guī)則，可能是由于乙醇和乙腈揮發(fā)性太強(qiáng)，導(dǎo)致孔壁上都粘有聚合物，有時(shí)甚至都揮發(fā)到密封袋上，給后續(xù)的吸附試驗(yàn)和檢測(cè)帶來(lái)很多困難，而且交聯(lián)劑用量少時(shí)，用乙醇作溶劑合成的聚合膜不能牢固地粘到板上，易脫落，形成的聚合膜易碎，洗脫時(shí)聚合膜易融化在甲醇乙酸混合洗脫液中。而用THF 作為溶劑，制備的CAP 聚合膜能牢固地粘在板上，無(wú)論如何洗脫都不會(huì)脫落，孔壁上也未粘有聚合物，洗脫后板可重復(fù)使用。所以，本試驗(yàn)中選用THF 作為溶劑，且溶劑的量為5 mL。

2.1.4 交聯(lián)劑用量的選擇 試驗(yàn)中模板分子CAP和功能單體DEAEM 的用量固定不變，按照CAP與交聯(lián)劑EGDMA 的摩爾比為1∶0.5、1∶1、1∶2和1∶3，選用不同用量的EGDMA，制備出一系列聚合物，洗脫后測(cè)定其吸附量。從表3可見(jiàn):當(dāng)CAP 與EGDMA 的摩爾比為1∶1 時(shí)，聚合膜的吸附量最大(1.49 μg/孔);隨著EGDMA 用量的增加，聚合膜的吸附量減少，可能是因?yàn)榻宦?lián)劑用量過(guò)多時(shí)，導(dǎo)致交聯(lián)太過(guò)致密，影響了CAP 分子空穴的形成，同時(shí)也由于交聯(lián)致密，導(dǎo)致洗脫困難，洗脫不完全，模板分子殘留在其中，使吸附量降低。所以，本試驗(yàn)中選用模板分子CAP 與交聯(lián)劑EGDMA的摩爾比為1∶1。

表2 功能單體DEAEM 用量對(duì)CAP 聚合膜吸附性的影響Tab.2 Influence of DEAEM amount on adsorption on the imprinted film

表3 交聯(lián)劑EGDMA 用量對(duì)CAP 聚合膜吸附性的影響Tab.3 Influence of EGDMA amount on the adsorption on the imprinted film

2.1.5 引發(fā)劑用量的選擇 將模板分子CAP、功能單體DEAEM和交聯(lián)劑EGDMA 按照1∶4∶1 的摩爾比固定不變，采用不同用量的引發(fā)劑AIBN(0.005、0.010、0.020、0.030、0.040 g)制備出一系列CAP 分子印跡聚合膜。結(jié)果表明:當(dāng)AIBN用量超過(guò)0.020 g 時(shí)，隨著AIBN 用量的增多，聚合物在孔壁上的形狀不規(guī)則，不具有膜的外觀，而且膜的吸附量也并未增加;但當(dāng)AIBN 用量過(guò)少時(shí)，雖然孔里形成的聚合物很整齊，具有膜的外觀，但膜的吸附量明顯降低。這可能是因?yàn)橐l(fā)劑用量過(guò)少時(shí)，導(dǎo)致引發(fā)力度過(guò)低，聚合反應(yīng)不充分，聚合膜的吸附量也隨之減少。所以，本試驗(yàn)中選用0.020 g AIBN 來(lái)引發(fā)聚合反應(yīng)。

2.1.6 聚合時(shí)間的選擇 將聚合物在紫外燈下分別照射4、5、6、12、18、24 h，然后用甲醇乙酸混合液洗脫模板分子。結(jié)果表明:聚合時(shí)間越長(zhǎng)，模板分子越難洗脫，不僅洗脫時(shí)間延長(zhǎng)，而且模板分子滲漏嚴(yán)重;聚合時(shí)間過(guò)短時(shí)，聚合反應(yīng)不完全，雖洗脫容易，但吸附量明顯減少。所以，本試驗(yàn)中選用6 h 作為聚合時(shí)間。

2.2 CAP 分子印跡聚合膜的吸附性

從圖1可見(jiàn):隨著CAP 初始濃度的增加，MIP和NIP 對(duì)CAP 的吸附量均增加，并且在每一初始濃度下，MIP 要比NIP 的吸附量多;當(dāng)CAP 初始濃度為120 mg/L 時(shí)，MIP 對(duì)CAP 的吸附量可達(dá)1.51 μg/孔，而NIP 對(duì)CAP 的吸附量?jī)H為0.85 μg/孔。

圖1 CAP 分子印跡膜的吸附性Fig.1 Adsorption isotherms of the imprinted and nonimprinted film

2.3 CAP 分子印跡膜的吸附動(dòng)力學(xué)曲線及吸附特異性

從CAP 分子印跡膜對(duì)CAP、TAP和FF 3種物質(zhì)的吸附動(dòng)力學(xué)曲線(圖2)可見(jiàn):印跡膜在20 min 內(nèi)就完成了對(duì)CAP 56%的吸附量，在50 min時(shí)基本達(dá)到吸附平衡;而印跡膜對(duì)TAP和FF 也都能吸附，但對(duì)FF和TAP 的吸附量均比CAP 少;達(dá)到吸附平衡時(shí)，印跡膜對(duì)CAP 的吸附量為0.83 μg/孔，而對(duì)TAP和FF 的吸附量分別僅為0.49、0.40 μg/孔。說(shuō)明CAP 分子印跡膜對(duì)CAP 的吸附具有特異性。

圖2 CAP 分子印跡膜的吸附動(dòng)力學(xué)曲線及吸附特異性Fig.2 Specificity of the chloramphenicol imprinted film

3 結(jié)論

本研究中，在96 孔板上制備了一種CAP 分子印跡膜，通過(guò)試驗(yàn)優(yōu)化了制備條件并測(cè)定了該膜的吸附量及吸附特異性。

(1)當(dāng)模板分子、功能單體DEAEM 與交聯(lián)劑EGDMA 的摩爾比為1∶4∶1，模板分子物質(zhì)的量為0.25 mmol，THF 溶劑的量為5 mL，在100 W 紫外燈下照射6 h 時(shí)，制備的CAP 分子印跡膜吸附效果最佳，可在50 min 內(nèi)達(dá)到吸附平衡，當(dāng)CAP 初始濃度為120 mg/L 時(shí)，吸附量可達(dá)1.51 μg/孔。

(2)吸附特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)CAP、TAP和FF 的初始濃度為50 mg/L，達(dá)到吸附平衡時(shí)，印跡膜對(duì)CAP 的吸附量為0.83 μg/孔，而對(duì)TAP和FF 的吸附量分別為0.49、0.40 μg/孔。說(shuō)明該膜對(duì)CAP 具有專一識(shí)別能力。

(3)與生物抗體的難制備相比，此膜用作人工抗體具有生物抗體所不可替代的優(yōu)勢(shì):制備成本低、穩(wěn)定性高、抗惡劣環(huán)境能力強(qiáng)、能重復(fù)使用。

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