超聲波輔助提取魚腦磷脂的研究

張麗，盧航，劉迪，劉鵬宇，朱瑤，胡建恩

(大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連116023)

鰹是金槍魚的一種，也是金槍魚類資源最豐富的魚種，年漁獲量幾乎占全世界金槍魚類漁獲量的50%，約150 萬t［1］。鰹主要被加工成罐頭，在其加工過程中，產(chǎn)生的副產(chǎn)物大約占體質(zhì)量的50% ～70%［2］，魚頭占副產(chǎn)物的比例較大，魚腦作為魚頭的一部分，除含有蛋白質(zhì)外，還含有豐富的磷脂，是可利用的磷脂資源。磷脂是含磷酸基團的類脂化合物，主要存在于植物種子以及動物的腦、肝、卵中，是細胞膜結(jié)構(gòu)的主要組成部分，具有調(diào)節(jié)膜酶活性、改善脂質(zhì)代謝等生理功能［3-4］。磷脂還具有乳化作用，已被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、皮革加工等行業(yè)［5］。本研究中，對超聲波輔助提取魚腦磷脂的提取效率進行了研究，以期為魚產(chǎn)品加工副產(chǎn)物中魚腦的高值化利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用鰹魚腦取自山東靖海實業(yè)有限公司水產(chǎn)品加工廠。

磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰膽堿(PC)、神經(jīng)鞘磷脂(SM)、溶血卵磷脂(LPC)標(biāo)準(zhǔn)品，均購于美國Sigma 公司;硅膠GF254 薄層層析板(10×20 cm)，購于青島海洋化工公司;乙醇、正己烷等其他試劑均為分析純。

儀器有超聲波發(fā)生器(KJ-600)、氣相色譜儀(GC-2010)、紫外可見光分光光度計(721 型)。

1.2 方法

1.2.1 超聲法提取磷脂的試驗流程 魚腦解凍破碎→正己烷-乙醇超聲提取→抽濾→磷脂萃取液→濃縮→冷丙酮提純→沉淀(磷脂)。

1.2.2 超聲法提取魚腦磷脂的試驗設(shè)計在恒定功率300 W 下，采用正己烷-乙醇混合溶劑提取魚腦中的磷脂。以溶劑混合比、固液比、超聲時間、超聲溫度和超聲提取次數(shù)作為影響因素進行單因素試驗，然后進行正交試驗優(yōu)化磷脂提取工藝條件。

1.2.3 氯仿-甲醇法提取磷脂 參照文獻［6］中的方法，用氯仿-甲醇法提取魚腦磷脂，因磷脂不溶于丙酮，故對提取的魚腦總脂肪用丙酮洗滌，獲取的不溶物即為粗磷脂。試驗步驟為:魚腦經(jīng)解凍勻漿后稱取10 g，在氯仿-甲醇溶劑中萃取，收集下層氯仿層，于38 ℃下真空濃縮后的樣液，經(jīng)冷丙酮反復(fù)洗滌至無色，收集沉淀即為磷脂樣品。

1.2.4 磷脂含量的測定和相對提取率的計算 參照GB/T 5537—2008 《糧油檢驗:磷脂含量的測定》中的方法進行分析測定。

相對提取率(K)的計算公式為

1.2.5 磷脂的定性分析 用氯仿溶解磷脂標(biāo)準(zhǔn)品配成1 mg/mL 溶液，將標(biāo)準(zhǔn)品與樣品點于同一硅膠GF254 薄層層析板上，在層析液(φ(氯仿)∶φ(甲醇)∶φ(水)=65∶25∶4)中展開，展距10 cm，用碘蒸氣顯色，通過比較樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的比移值(Rf)，來確定樣品中磷脂的組成成分。

1.2.6 脂肪酸分析 制取的魚腦磷脂采用三氟化硼法甲酯化［7］后，參照《GB/T 17377—2008 動植物油脂脂肪酸甲脂的氣相色譜分析》中的方法進行氣相色譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 用超聲法提取鰹魚腦磷脂條件的單因素試驗

2.1.1 提取溶劑 一般非極性溶劑適合于溶解游離態(tài)的脂類，對結(jié)合態(tài)的脂類提取效率不高。天然產(chǎn)物中磷脂常與蛋白結(jié)合［8］，為此，本試驗中選用混合溶劑進行提取，其優(yōu)勢在于極性溶劑乙醇的加入可以破壞磷脂和蛋白質(zhì)的結(jié)合，提高磷脂的得率。在提取溫度為35 ℃、超聲提取時間為30 min、固液比(均為g∶mL)為1∶5、超聲輔助提取一次的條件下，正己烷與乙醇的不同配比對磷脂提取率的影響如圖1所示。從圖1可見，磷脂的提取率隨著正己烷與乙醇配比的改變呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)正己烷與乙醇溶劑的體積比為3∶1、2∶1、1∶1時，相對提取率分別為35.5%、51.6%和32.2%。因此，本試驗條件下，選用正己烷與乙醇的溶劑比為2∶1 時，磷脂提取效果最好。

2.1.2 提取時間在正己烷與乙醇的溶劑比為2∶1、溫度為35 ℃、提取時間為30 min、固液比為1∶5、超聲波輔助提取一次的條件下，不同提取時間對磷脂提取率的影響如圖1所示。從圖1可見，磷脂相對提取率隨著提取時間的延長逐漸升高，而當(dāng)提取時間為40 ～70 min 時，相對提取率的增加趨勢變緩。因此，在本試驗條件下，提取時間選擇40 min 時，磷脂提取效果較好。

2.1.3 固液比在正己烷與乙醇的溶劑比為2∶1、溫度為35 ℃、超聲時間為40 min、超聲提取一次的條件下，不同固液比對磷脂提取率的影響如圖1所示。從圖1可見:磷脂相對提取率隨著固液比的增大呈上升趨勢。當(dāng)固液比為1∶9 時，相對提取率達到74.1%;當(dāng)固液比增大到1∶11 時，提取率變化不大。因此，本試驗條件下，選擇固液比為1∶9時，既能節(jié)約溶劑又能保證磷脂提取效果。

圖1 正己烷與乙醇的配比、超聲提取時間、固液比、溫度、超聲提取次數(shù)對磷脂提取率的影響Fig.1 Effect of n-hexane/ethanol ratio，ultrasonic extractive time，solid-liquid ratio，temperature，and ultrasonic frequency on the extraction rate of the phospholipids

2.1.4 溫度在正己烷與乙醇的溶劑比為2∶1、超聲時間為40 min、固液比為1∶9、超聲提取一次的條件下，不同溫度對磷脂提取率的影響如圖1所示。從圖1可見，溫度為15 ～35 ℃時，磷脂的相對提取率隨溫度的升高逐漸增加，由48.4%增加到78.1%，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，磷脂的相對提取率卻逐漸下降。有研究表明，溫度升高使分子動能增加，從而提高萃取效率，但溫度過高時又會使卵磷脂氧化降解，磷脂含量降低［8］。因此，本試驗條件下，選擇溫度為35 ℃時磷脂提取效果最好。

2.1.5 超聲提取次數(shù)在正己烷與乙醇的溶劑比為2∶1、超聲時間為40 min、固液比為1∶9、溫度為35 ℃的條件下，超聲提取次數(shù)對魚腦磷脂提取率的影響如圖1所示。從圖1可見，磷脂提取率隨超聲提取次數(shù)的增加而增加，但超聲提取3次與2次相比，磷脂提取率的變化不大。因此，本試驗條件下，選擇超聲提取次數(shù)為2 時，磷脂提取效果較好。

2.2 超聲提取法的正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇在恒定功率為300 W，超聲提取2次的條件下，以混合溶劑配比、超聲提取時間、固液比和溫度為因素，以磷脂相對提取率為指標(biāo)，按L9(34)進行正交試驗設(shè)計，因素水平表如表1所示。

表1 因素水平表Tab.1 The table of factors and levels

表2 磷脂提取正交試驗設(shè)計方案與結(jié)果Tab.2 Results and analysis in the orthogonal experiment of phospholipids

由極差分析結(jié)果表明:用超聲法提取魚腦磷脂的過程中，溶劑配比對磷脂的提取率影響最大，各因素對提取效果的影響程度依次為溶劑配比、提取時間、固液比、提取溫度，最佳試驗組合為A3B2C2D3，即當(dāng)超聲功率為300 W、正己烷與乙醇的溶劑比為2∶1、超聲提取時間為40 min、固液比為1∶9、溫度為35 ℃、超聲提取2次的最優(yōu)工藝條件下，磷脂的提取率最高。在此最優(yōu)工藝條件下進行驗證試驗，可從每克魚腦中(濕質(zhì)量)中提取得到19.59 mg 磷脂，與氯仿-甲醇法(22.49 mg)相比，磷脂的相對提取率達到87.1%。由于氯仿、甲醇的毒性較高，具有損傷眼膜和致癌的作用，而本試驗中選用正己烷與乙醇，在保證一定提取效率的前提下，又相對降低了溶劑的毒性，是較為安全有效的磷脂提取方法，可以替代氯仿-甲醇法提取磷脂。

2.3 鰹魚腦磷脂的組分分析

從超聲提取的鰹魚腦磷脂與磷脂標(biāo)準(zhǔn)品的薄層色譜圖(圖2)可知，鰹魚腦中含有4種磷脂成分，對照比移值可知其中3種為PE、PC、SM，第四點(X)未能確定其成分，依據(jù)文獻［9］報道，推測X 點可能為磷脂酰甘油(PG)。此外PE、PC 所對應(yīng)的斑點面積較大，分析其中PE和PC 含量相對較高。

圖2 鰹魚腦磷脂薄層色譜圖Fig.2 Thin-layer chromatogram of phospholipids extracted from Skipjack brain

2.4 鰹魚腦磷脂的脂肪酸組成分析

通過氣相色譜分析了鰹魚腦中磷脂的脂肪酸組成。從表3可見:鰹魚腦中磷脂的脂肪酸主要由C16∶0、C18∶0、C18∶1n9c、C20∶5n3、C22∶6n3構(gòu) 成，且DHA(二十二碳六烯酸)和EPA(二十碳五烯酸)含量分別為21.1%和2.4%，說明鰹魚腦中有較高含量的富含DHA、EPA 的磷脂存在。而大豆和蛋黃磷脂的脂肪酸主要由C16∶0、C18∶1、C18∶2構(gòu)成，不含DHA和EPA［10］。有研究表明，海參磷脂的不飽和度遠大于大豆磷脂，對小白鼠增強脂肪代謝和控制糖代謝方面的效果也優(yōu)于大豆磷脂，可以明顯抑制小白鼠體質(zhì)量的增長［11］。所以，魚腦磷脂的利用價值應(yīng)高于目前一般使用的大豆和蛋黃磷脂。

表3 鰹魚腦磷脂的脂肪酸組成Tab.3 The fatty acid composition of phospholipids from skipjack brain

3 結(jié)語

超聲波輔助提取是一個物理提取過程，其優(yōu)點在于此過程中無化學(xué)反應(yīng)發(fā)生，提取物的生物活性相對穩(wěn)定［12］。本試驗中將超聲技術(shù)應(yīng)用于鰹魚腦磷脂的提取，結(jié)果表明，該法提取磷脂具有可行性。通過薄層色譜分析，確定鰹魚腦中含有PE、PC、SM，還可能含有PG。

目前，國內(nèi)外對大豆和蛋黃磷脂的研究居多，對海洋磷脂的研究相對較少。比較鰹魚腦磷脂、大豆和蛋黃磷脂的脂肪酸組成，發(fā)現(xiàn)鰹魚腦磷脂中含有更豐富的DHA和EPA，可能比大豆磷脂和蛋黃磷脂具有更豐富的生物活性。用超聲法提取鰹魚腦磷脂的研究，既為有效地利用鰹魚頭資源提供科學(xué)依據(jù)，也為海洋磷脂的開發(fā)提供了新思路。

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