海帶粉對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)、非特異性免疫和肝胰臟抗氧化能力的影響

楊維維，劉文斌，沈美芳，唐建清，朱杰，錢(qián)妤

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 江蘇省水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210095;2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京210017)

海帶屬于褐藻綱、海帶科植物，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的海洋性蔬菜，含有豐富的海藻多糖、膳食纖維、礦物質(zhì)元素、多種維生素［1］、氨基酸、酶類和促生長(zhǎng)活性因子，為典型碘化合物富集體。根據(jù)測(cè)定，每克海帶中含碘量高達(dá)24 mg，且所含的礦物質(zhì)和絕大多數(shù)微量元素均以有機(jī)態(tài)形式存在，不易發(fā)生氧化，吸收利用率高。海帶中的海藻膠、褐藻糖膠是天然優(yōu)質(zhì)黏合劑，可以增強(qiáng)魚(yú)蝦類飼料的穩(wěn)定性，提高飼料利用率，防止水質(zhì)污染［2］。海帶蛋白對(duì)動(dòng)物體內(nèi)的大腸桿菌Escherichia coli、產(chǎn)氣桿菌Anthraci、金色葡萄球菌Staphy lococcus aureus 具有抑制作用［3］。海帶粉作為一種良好的飼料添加劑，國(guó)內(nèi)已在畜禽生產(chǎn)中廣泛使用，但在對(duì)蝦商品飼料中也有部分生產(chǎn)廠家使用了海帶粉。在礦物質(zhì)和微量元素貧乏的水體中，投喂添加海帶粉的飼料對(duì)魚(yú)蝦的生長(zhǎng)和病害防治都有明顯的效果［4］。

克氏原螯蝦Procambarus clarkii 隸屬于甲殼綱、十足目、螯蝦科、原螯蝦屬［5］，是中國(guó)目前重要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象，養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴(kuò)大。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)螯蝦的野外食性以及環(huán)境對(duì)螯蝦進(jìn)食的影響等食性特征進(jìn)行了研究，但對(duì)海帶粉在克氏原螯蝦飼料的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，探討了飼料中添加不同水平的海帶粉對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)性能、非特異性免疫指標(biāo)和肝胰臟抗氧化功能的影響，以期為克氏原螯蝦人工配合飼料中合理添加海帶粉提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用克氏原螯蝦取自江蘇盱眙滿江紅養(yǎng)殖基地。選擇體質(zhì)健壯、規(guī)格基本一致，體質(zhì)量為(7.25±0.24)g 的克氏原螯蝦用于試驗(yàn)。

海帶粉購(gòu)自西安小草植物科技有限公司，其營(yíng)養(yǎng)成分(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)):粗蛋白質(zhì)為8.2%，粗脂肪為0.3%，甘露醇為10% ～15%，粗纖維為5% ～6%，礦物質(zhì)為25% ～27%，褐藻膠為20% ～24%。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)5 組，每組設(shè)3 個(gè)平行，試驗(yàn)在15 個(gè)網(wǎng)箱(規(guī)格為0.5 m×0.5 m×0.5 m)中進(jìn)行，每個(gè)網(wǎng)箱放養(yǎng)20 只克氏原螯蝦。其中一組為對(duì)照組，投喂基礎(chǔ)飼料;另外4 組為試驗(yàn)組，投喂基礎(chǔ)飼料中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、2.0%、4.0%海帶粉的飼料。

試驗(yàn)飼料的基礎(chǔ)配方(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)):魚(yú)粉(5.00%)、豆粕(31.25%)、菜籽粕(16.00%)、蝦糠粉(3.00%)、面粉(31.29%)、α -淀粉(4.00%)、豆油(3.21%)、棒土(1.00%)、沸石粉(1.50%)、磷酸二氫鈣(2.20%)、食鹽(0.40%)、復(fù)合預(yù)混料(1.00%)和脫殼素(0.15%)。其中復(fù)合預(yù)混料(每kg 飼料)包含:維生素E 150 mg，維生素K 50 mg，維生素B180 mg，維生素B250 mg，煙酸150 mg，泛酸150 mg，維生素B650 mg，生物素1 mg，維生素B120.02 mg，葉酸10 mg，維生素C 300 IU，維生素A 10 000 IU，維生素D 2000 IU，硫酸銅2.0 g，硫酸鐵25 g，硫酸鋅22 g，硫酸錳7 g，亞硒酸鈉0.04 g，碘化鉀0.026 g，氯化鈷0.1 g。各試驗(yàn)組飼料中分別加入0、0.5%、1.0%、2.0%、4.0 %的海帶粉代替部分面粉?；A(chǔ)飼料的營(yíng)養(yǎng)成分:粗蛋白質(zhì)為26%，粗脂肪為6%。飼料原料經(jīng)粉碎過(guò)60 目篩，逐級(jí)混勻后加水?dāng)嚢?，用小型絞肉機(jī)制成粒徑為2 mm 的顆粒，自然晾干后在冰箱(4 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試驗(yàn)管理 克氏原螯蝦在試驗(yàn)網(wǎng)箱中馴化15 d 后投喂試驗(yàn)飼料，每天 8:00、16:00、22:00 投喂。日投餌量為蝦體質(zhì)量的4% ～6%，上午和下午的投餌量均為日投餌量的30%，晚上為40%。并根據(jù)攝食和生長(zhǎng)情況作適當(dāng)調(diào)整，以每次投飼2 h 后無(wú)殘餌為宜，飼養(yǎng)試驗(yàn)共進(jìn)行8周。飼養(yǎng)期間，水溫為(25±3)℃，溶氧為7 ～8 mg/L，pH 保持在7.0 ～8.0。

1.2.3 生長(zhǎng)性能的測(cè)定 飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，將各網(wǎng)箱中克氏原螯蝦計(jì)數(shù)、稱重，統(tǒng)計(jì)投喂所用飼料重，并計(jì)算成活率、增重率、特定生長(zhǎng)率、餌料系數(shù)。計(jì)算公式如下:

其中:N0、Nt分別為試驗(yàn)初始和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)蝦的存活數(shù);W0、Wt分別為試驗(yàn)初始和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)蝦體質(zhì)量(g);t 為試驗(yàn)時(shí)間(d);F 為飼料攝入量(g)。

1.2.4 血液生化指標(biāo)的測(cè)定 試驗(yàn)結(jié)束后，從各網(wǎng)箱中隨機(jī)取5 只蝦，用無(wú)菌注射器從蝦體圍心腔中取血，將血液置于無(wú)菌離心管中，于冰箱(4℃)中過(guò)夜后離心，得到的血清用于溶菌酶(LSZ)、堿性磷酸酶(AKP)、總蛋白(TP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)的測(cè)定。采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定血漿中的TP 濃度，采用磷酸苯二鈉比色法測(cè)定AKP 的活力，其他指標(biāo)均按照南京建成生物公司研究所提供的試劑盒方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 組織營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定 從抽取過(guò)血液的每只蝦中取肝胰腺、肌肉和腸道，用生理鹽水沖洗后用濾紙吸去組織樣品表面的水分，放入凍存管中置于液氮中速凍，并置于冰箱(-20 ℃)中保存，用于營(yíng)養(yǎng)成分和相關(guān)酶活性的測(cè)定分析。肝胰臟樣品解凍后稱重，肝胰臟與生理鹽水按質(zhì)量比為1∶9 混合，冰浴勻漿，然后于4 ℃下以4000 r/min 離心10 min，取上清液用于超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的測(cè)定，各項(xiàng)指標(biāo)均按照南京建成生物公司研究所提供的試劑盒方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±S.E.)表示，用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan 氏法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 海帶粉對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)性能的影響

從表1可見(jiàn):海帶粉添加組的增重率均較對(duì)照組高，隨著海帶粉添加量的增加蝦的增重率呈先升高后降低的趨勢(shì)，其中僅2.0%添加組與對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.05);飼料中添加海帶粉，可以提高蝦的成活率，蝦的成活率隨著添加量的增加而提高，當(dāng)添加量為2.0%和4.0%時(shí)與對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.05);餌料系數(shù)隨著海帶粉的添加顯著下降(P＜0.05)(除4.0%組外)，但各添加組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

表1 海帶粉對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)性能的影響Tab.1 Effects of kelp powder on growth of red swamp crawfish Procambarus clarkia

2.2 海帶粉對(duì)克氏原螯蝦血清生化指標(biāo)的影響

從表2可見(jiàn):海帶粉添加組蝦血清中的LSZ 活性均較對(duì)照組顯著升高(P＜0.05)，當(dāng)添加量達(dá)到1.0%和2.0%時(shí)LSZ 活性最強(qiáng);海帶粉添加組蝦血清中的TP 濃度較對(duì)照組均有所上升，當(dāng)添加量為2.0%時(shí)TP 濃度最高(P＜0.05);AKP 活性則隨著海帶粉添加量的增加顯著升高(P＜0.05)，當(dāng)添加量為1.0%和2.0%時(shí)AKP 活性最強(qiáng);GPT和GOT 活性隨著海帶粉添加量的增加沒(méi)有顯著變化(P＞0.05)。

表2 海帶粉對(duì)克氏原螯蝦血清生化指標(biāo)的影響Tab.2 Effects of kelp powder on serum biochemical parameters of red swamp crawfish Procambarus clarkia

2.3 海帶粉對(duì)克氏原螯蝦肝胰臟抗氧化能力的影響

從表3可見(jiàn):克氏原螯蝦肝胰臟中的SOD、CAT和GSH 活性均隨著飼料中海帶粉添加量的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，而MDA 含量的變化趨勢(shì)正好相反。海帶粉添加量為1.0% ～4.0% 時(shí)，肝胰臟中的SOD 活性與對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.05)，當(dāng)添加量為2.0%時(shí)SOD 活性最強(qiáng);海帶粉添加組的CAT、GSH 活性均較對(duì)照組顯著升高(P＜0.05)，當(dāng)海帶粉添加量為1.0%時(shí)CAT、GSH活性最強(qiáng);海帶粉添加組的MDA 含量與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，當(dāng)添加量為2.0%時(shí)MDA含量最低。

表3 海帶粉對(duì)克氏原螯蝦肝胰臟抗氧化功能的影響Tab.3 Effects of kelp powder on hepatopancreatic antioxidant capacity of red swamp crawfish Procambarus clarkia U/mg

3 討論

海帶是一種典型的碘富集體，可以提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能和免疫功能。本研究結(jié)果顯示:飼料中添加海帶粉對(duì)克氏原螯蝦的增重率有一定的提升作用，但只有當(dāng)添加量達(dá)到2.0%時(shí)顯著上升;蝦的死亡率隨著海帶粉添加量的增加呈直線下降的趨勢(shì);而餌料系數(shù)則呈先降低后升高的趨勢(shì)，在添加量為1.0%時(shí)達(dá)到最低值。劉立鶴等［6］研究表明，飼料中海帶粉添加量為0.4%時(shí)，凡納濱對(duì)蝦對(duì)飼料粗蛋白的表觀消化率最高，當(dāng)添加量為3.2%、6.4%時(shí)，增重率最高。周歧存等［7-8］用添加不同水平的海藻(3%、6%、9%、12%)飼料投喂凡納濱對(duì)蝦和南美白對(duì)蝦，結(jié)果3%海藻添加組的增重率最高，且凡納濱對(duì)蝦的飼料利用率最高，這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。因此，在本試驗(yàn)設(shè)置的添加量范圍內(nèi)，添加1.0% ～2.0%的海帶粉對(duì)克氏原螯蝦的促生長(zhǎng)和節(jié)約飼料效果最為顯著，這與海帶粉中含有豐富的多糖和甘露醇(寡糖)等有關(guān)。甘露醇是一種很好的化學(xué)益生素，可以提供碳源被多數(shù)動(dòng)物腸道分解，促進(jìn)雙歧桿菌等有益微生物增殖，進(jìn)而抑制有害菌的生長(zhǎng)、繁殖，促進(jìn)動(dòng)物健康生長(zhǎng)。

血液成分的變化被廣泛用來(lái)評(píng)價(jià)蝦類的健康和營(yíng)養(yǎng)狀況，血液成分是重要的生理、病理和毒理學(xué)指標(biāo)［9］。蝦體受到外界影響發(fā)生生理或病理變化時(shí)，必然會(huì)在血液指標(biāo)中反映出來(lái)。溶菌酶是動(dòng)物體內(nèi)重要的非特異性免疫因子之一，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有較強(qiáng)的殺滅作用［10］，動(dòng)物體內(nèi)溶菌酶的活性和抗菌活力直接關(guān)系到魚(yú)類的免疫功能和健康，研究表明，水生動(dòng)物機(jī)體的免疫力隨著溶菌酶活性的上升而提高［11］。堿性磷酸酶是生物體內(nèi)一種重要的代謝調(diào)控酶，可以直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和鈣磷代謝，在魚(yú)蝦類對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，有助于提高魚(yú)蝦的抗病力［12］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加海帶粉后均可提高克氏原螯蝦血清的TP 濃度，增加蝦體蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)其生長(zhǎng)，其中2.0%海帶粉添加組蝦血清的TP 濃度較對(duì)照組顯著上升(P＜0.05)，但與其他試驗(yàn)組無(wú)顯著性差異;各添加組蝦血清的LSZ和APK 酶活性較對(duì)照組顯著上升(P＜0.05)，且隨著添加量的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，分別在添加量為1.0%和2.0%時(shí)達(dá)到最大值。由此可見(jiàn)，飼料中添加海帶粉可以提高克氏原螯蝦的免疫功能，添加量為1.0%和2.0% 時(shí)效果最為顯著。EI-Boshy等［13］研究表明，在尼羅羅非魚(yú)Oreochromis niloticus 飼料中添加海帶提取物褐藻淀粉能提高魚(yú)體的巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)指數(shù)、噬菌細(xì)胞活性和血清溶菌酶活性，這說(shuō)明海帶中的多糖可以通過(guò)提高溶菌酶的活性來(lái)增強(qiáng)蝦體的免疫能力。

GPT、GOT是重要的氨基酸轉(zhuǎn)氨酶，在機(jī)體蛋白質(zhì)代謝中起著重要作用，其活性變化也是反映肝細(xì)胞生理狀態(tài)的主要敏感指標(biāo)。血清中轉(zhuǎn)氨酶活性值正常情況下較小，當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性加大，大量GPT、GOT 滲入血液，肝臟中的GPT、GOT 活性明顯下降［14］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加海帶粉對(duì)克氏原螯蝦肝胰臟中的GPT、GOT 沒(méi)有顯著影響(P＞0.05)，說(shuō)明海帶對(duì)其肝功能不會(huì)造成損傷。董學(xué)興等［1］研究表明，在飼料中添加海帶粉對(duì)異育銀鯽血清GPT、GOT 活性沒(méi)有顯著影響，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。海帶對(duì)肝臟的保護(hù)作用與其含有豐富的多糖有關(guān)，海帶多糖具有清除自由基及抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用［15-16］。

抗氧化系統(tǒng)能清除體內(nèi)多余的活性氧，保護(hù)自身免受氧化損傷，防止各種病理變化。SOD、CAT、MDA、GSH 均是用于衡量動(dòng)物機(jī)體內(nèi)抗氧化功能的代表性指標(biāo)［17-18］。SOD、CAT 能夠清除自由基，減少脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。GSH 能幫助機(jī)體保持正常的免疫系統(tǒng)功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用。應(yīng)激會(huì)造成機(jī)體內(nèi)自由基產(chǎn)生增多，過(guò)多的自由基等活性氧可造成脂質(zhì)過(guò)氧化，增加了體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物進(jìn)一步分解產(chǎn)生的具有很強(qiáng)生物毒性的物質(zhì)，MDA 會(huì)對(duì)機(jī)體造成傷害，反映了細(xì)胞的受損傷程度和脂質(zhì)過(guò)氧化程度［19］。本研究中，飼料中添加海帶粉對(duì)蝦體肝胰臟中的SOD、CAT和GSH 活性均有顯著的提升作用，當(dāng)添加量達(dá)到1.0%時(shí)，CAT、GSH 的抗氧化效果最為顯著;添加量為2.0%時(shí)，SOD 的抗氧化效果最為顯著;MDA 則隨著海帶粉添加量的增加呈先降低后升高的趨勢(shì)，在添加量為2.0%時(shí)MDA 含量最低。由此可知，飼料中添加海帶粉可以提高克氏原螯蝦肝胰臟的抗氧化能力，當(dāng)添加量為1.0% ～2.0%時(shí)抗氧化效果最為顯著。

綜上所述，在基礎(chǔ)飼料中添加海帶粉可以促進(jìn)克氏原螯蝦的生長(zhǎng)，提高蝦體的非特異性免疫力和抗氧化能力，對(duì)抗病防病有一定的效果。當(dāng)海帶粉添加量為1.0% ～2.0%時(shí)效果最佳，故建議克氏原螯蝦飼料中海帶粉的添加量為1.0% ～2.0%。

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