小體鱘雌性親魚(yú)性腺不同發(fā)育時(shí)期消化酶分布及其活性的研究

徐翱，劉曉勇，張穎，潘鵬，孫大江

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱150070;3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京100039)

鱘魚(yú)是鱘形目魚(yú)類的統(tǒng)稱，全球現(xiàn)存約27種，屬大型經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，廣泛分布于北回歸線以北的水域中［1］。中國(guó)是鱘魚(yú)資源較為豐富的國(guó)家之一，據(jù)記載分布有8種鱘魚(yú)，也是全世界最大的鱘魚(yú)養(yǎng)殖國(guó)家，2012年中國(guó)鱘魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量占世界鱘魚(yú)總產(chǎn)量的85%以上［2］。鱘魚(yú)的全人工繁殖已取得成功，為規(guī)模化養(yǎng)殖提供了基本保證，但人工培育親魚(yú)的再繁殖效率(催產(chǎn)率、受精率、孵化率等)普遍不高［3］。親魚(yú)階段作為魚(yú)類的一個(gè)特殊生理階段，其營(yíng)養(yǎng)需求與成魚(yú)和幼魚(yú)的營(yíng)養(yǎng)需求不同［4］。親魚(yú)的營(yíng)養(yǎng)對(duì)提高產(chǎn)卵量、卵與仔魚(yú)質(zhì)量，促進(jìn)仔稚魚(yú)生長(zhǎng)與存活等均具有重要作用，而親魚(yú)培育質(zhì)量和繁殖效果主要取決于培育環(huán)境和配合飼料的質(zhì)量，所以優(yōu)化親魚(yú)飼料有助于提高其繁殖性能［5-6］。消化系統(tǒng)分泌的消化酶活力的高低直接影響親魚(yú)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化能力，從而影響性腺的發(fā)育［7-8］。有關(guān)水產(chǎn)動(dòng)物繁殖期消化酶的研究，僅見(jiàn)對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦、中華絨螯蟹和九孔鮑等的研究［9-10］。有關(guān)鱘魚(yú)養(yǎng)殖和人工繁殖技術(shù)方面的研究報(bào)道較多，而對(duì)消化能力和營(yíng)養(yǎng)需求等方面的研究較少，僅見(jiàn)Fabio等［11］對(duì)高首鱘Acipenser transmontanu、張穎等［12］對(duì)施氏鱘Acipenser schrenckii等的研究。對(duì)鱘魚(yú)消化酶的研究多集中于消化酶的種類、性質(zhì)，幼體發(fā)育不同階段酶活力的變化，以及水環(huán)境因子、餌料對(duì)消化酶的影響等方面［13-15］，對(duì)鱘親魚(yú)不同性腺發(fā)育時(shí)期相關(guān)營(yíng)養(yǎng)需求的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，以小體鱘Acipenser ruthenus Linnaeus 親魚(yú)為對(duì)象，研究其性腺不同發(fā)育階段的消化酶活性，為了解和掌握鱘親魚(yú)不同發(fā)育階段的營(yíng)養(yǎng)生理需求，科學(xué)配制親魚(yú)飼料和制定合理飼育策略，提高人工繁殖效率提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用魚(yú)均為中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院鱘魚(yú)繁育技術(shù)工程中心的小體鱘親魚(yú)，試驗(yàn)魚(yú)為7 齡性成熟親魚(yú)，從2012年6月25日至2013年3月25日共進(jìn)行4次采樣，每次間隔3 個(gè)月，共采集12 尾雌魚(yú)，體長(zhǎng)為(65 ±5)cm，體質(zhì)量為(2.75 ±0.5)kg。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 將試驗(yàn)魚(yú)置于冰盤(pán)上活體解剖，取出全部消化器官，剔除其上的結(jié)締組織和脂肪，分離出胃、幽門盲囊和腸道，并將腸道的前腸、中腸和后腸分裝，用預(yù)冷生理鹽水快速?zèng)_洗，清除內(nèi)容物并用脫脂棉小心揩干，放入冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 卵巢發(fā)育分期和腸道前中后腸的界定 卵巢發(fā)育分期依據(jù)蘇聯(lián)學(xué)者桀特拉弗等［16］提出的分期標(biāo)準(zhǔn)，以觀察外部形態(tài)和顯微鏡下觀察組織壓片相結(jié)合的方法來(lái)確定，將卵巢發(fā)育分為Ⅱ～Ⅵ期。卵巢發(fā)育各期的界定，是以在卵巢切面中所占面積超過(guò)50%的生殖細(xì)胞的時(shí)相為準(zhǔn)。

鱘魚(yú)腸道通常分為前腸、中腸、后腸，胃向后和幽門盲囊與十二指腸連接處為前腸，呈“乙”狀彎曲;前腸先從右往左拐，后又形成一個(gè)彎曲，此彎曲部分即為中腸，中腸部分比較短并較前腸細(xì);腸管的最后一個(gè)彎曲處為中腸與后腸的分界點(diǎn)，后腸是十二指腸后面較粗的瓣腸部分，其內(nèi)約有7 個(gè)螺旋瓣，后腸向肛門處逐漸縮?。?7-18］。

1.2.3 酶液的制備 將已經(jīng)處理好的胃、幽門盲囊、前腸、中腸、后腸取出，放在濾紙上去冰，分別稱重，按質(zhì)量與體積比為1∶ 9(g∶ mL)在樣品中加入0.85%預(yù)冷的生理鹽水，用高速組織勻漿機(jī)在冰浴中勻漿，所得勻漿液在4 ℃下以3500 r/min 離心15 min，提取組織勻漿上清液即為消化酶樣品，置于冰箱(-80 ℃)中保存，6 d 內(nèi)測(cè)定完畢。

1.2.4 酶活性的測(cè)定 樣品的蛋白濃度、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均采用南京建成生物工程研究所的相應(yīng)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

蛋白酶活性單位定義:每毫克組織蛋白37 ℃下每分鐘分解蛋白生成1 μg 氨基酸相當(dāng)于1 個(gè)酶活力單位。

脂肪酶活性單位定義:在37 ℃條件下，每克組織蛋白在反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol 底物為1 個(gè)酶活力單位。

淀粉酶活性單位定義:組織中每毫克蛋白在37 ℃下與底物作用30 min，水解10 mg 淀粉為1個(gè)酶活力單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel和SPSS Statistics 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，描述性統(tǒng)計(jì)值使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±S.D.)表示，采用Duncan's法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 小體鱘雌性親魚(yú)蛋白酶活性的變化

從表1可見(jiàn):小體鱘雌性親魚(yú)性腺發(fā)育過(guò)程中，5種消化器官中的蛋白酶活性均無(wú)顯著性差異(P ＞0.05)，蛋白酶活性均以幽門盲囊、后腸中較高，其次為胃、中腸，前腸最低;不同性腺發(fā)育時(shí)期，各消化器官中的蛋白酶活性均以性腺發(fā)育Ⅱ期、Ⅲ期較高，Ⅳ期較低，其中胃和幽門盲囊中的蛋白酶活性性腺發(fā)育Ⅱ期顯著高于其他發(fā)育時(shí)期(P＜0.05)，其余組織各性腺發(fā)育期間均無(wú)顯著性差異(P ＞0.05)。

表1 小體鱘雌性親魚(yú)不同消化器官中的蛋白酶活性Tab.1 Protease activities in different organs of female sterlet broodstocks U/mg

2.2 小體鱘雌性親魚(yú)淀粉酶活性的變化

從表2可見(jiàn):小體鱘雌性親魚(yú)性腺發(fā)育過(guò)程中，5種消化器官中的淀粉酶活性以中腸最高，依次為中腸、胃、幽門盲囊、前腸、后腸，其中性腺發(fā)育Ⅱ期中，中腸的淀粉酶活性顯著高于前腸(P＜0.05)，性腺發(fā)育Ⅳ期中，中腸的酶活性顯著高于其他器官(P＜0.05)，其余性腺發(fā)育時(shí)期，各器官中的酶活性均無(wú)顯著性差異(P ＞0.05);不同性腺發(fā)育時(shí)期，各消化器官中的淀粉酶活性均以性腺發(fā)育Ⅴ期較高，Ⅳ期較低(中腸除外)，其中胃和前腸中的淀粉酶活性Ⅴ期顯著高于Ⅳ期(P＜0.05)，其余組織各發(fā)育期間均無(wú)顯著性差異(P ＞0.05)。

表2 小體鱘雌性親魚(yú)不同消化器官中的淀粉酶活性Tab.2 Amylase activities in different organs of female sterlet broodstocks U/mg

2.3 小體鱘雌性親魚(yú)脂肪酶活性的變化

從表3可見(jiàn):小體鱘雌性親魚(yú)性腺發(fā)育過(guò)程中，5種消化器官中的脂肪酶活性以幽門盲囊最高，其次是中腸、前腸和胃，后腸最低，其中各性腺發(fā)育時(shí)期中，后腸中的酶活性均顯著低于其他各器官(P＜0.05);不同性腺發(fā)育時(shí)期，各消化器官中的脂肪酶活性以Ⅴ期、Ⅱ期較高，Ⅳ期較低(后腸除外)，其中胃中的酶活性Ⅴ期顯著高于其他發(fā)育期(P＜0.05);幽門盲囊中的酶活性Ⅴ期顯著高于Ⅲ期和Ⅳ期(P＜0.05)，而后腸中的酶活性隨性腺的發(fā)育呈遞減趨勢(shì)，且Ⅴ期顯著低于Ⅱ期(P＜0.05)。

表3 小體鱘雌性親魚(yú)不同消化器官中的脂肪酶活性Tab.3 Lipase activities in different organs of female sterlet broodstock U/g

3 討論

3.1 小體鱘親魚(yú)消化酶分布的特點(diǎn)

研究資料表明，鱘科魚(yú)類的胃、腸道結(jié)構(gòu)與其他魚(yú)類不同，導(dǎo)致其胃、腸道的消化酶活性也與其他魚(yú)類具有一定的差異性。鱘魚(yú)的胃具有較厚的肌層，腸道較短，具有特殊的螺旋瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)［19-23］，這種結(jié)構(gòu)相當(dāng)于增加了腸道的長(zhǎng)度，延長(zhǎng)了食物在腸道中停留的時(shí)間，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，因此，其腸道消化酶活性要高于其他消化器官，但也具有一定的種屬特異性。

鱘科魚(yú)類的蛋白酶組織活性具有種屬特異性。葉繼丹等［24］研究表明，鱘魚(yú)的蛋白酶和脂肪酶活性均以幽門盲囊中含量最高，淀粉酶活性以中腸中含量最高;伍莉等［25］對(duì)施氏幼鱘蛋白酶的研究表明，施氏鱘幽門盲囊和腸道中蛋白酶活性很高。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，可以認(rèn)為，鱘魚(yú)對(duì)蛋白質(zhì)的消化主要集中在幽門盲囊和腸道內(nèi)，而胃對(duì)蛋白質(zhì)的消化作用卻不明顯。尾崎久雄［26］研究表明，匙吻鱘胃中的蛋白酶活性顯著高于其他消化器官，魚(yú)類的幽門盲囊和腸道內(nèi)在中性和弱堿性條件下存在一定量的蛋白酶活性，而胃內(nèi)的蛋白酶只有在強(qiáng)酸條件下才能分解蛋白質(zhì)，表明匙吻鱘胃內(nèi)酸堿度與其他鱘科魚(yú)類不同。

魚(yú)類對(duì)脂肪的消化主要在其腸道的后部進(jìn)行，特別是腸道較短的肉食性魚(yú)類，這表明魚(yú)類消化器官的組織結(jié)構(gòu)和消化機(jī)能是與其食性相適應(yīng)的［27］。本試驗(yàn)中，小體鱘親魚(yú)的脂肪酶活性以幽門盲囊最高，其次是腸道，與中華鱘和匙吻鱘幼魚(yú)幽門盲囊的脂肪酶含量低、腸道活性高的變化規(guī)律不同，其原因可能是親魚(yú)的消化酶特點(diǎn)與幼魚(yú)不同，表明鱘親魚(yú)的幽門盲囊也參與脂肪的消化。與其他鱘科魚(yú)類的淀粉酶活性變化規(guī)律相同，小體鱘親魚(yú)的淀粉酶活性在各消化器官中差異不顯著。

3.2 小體鱘親魚(yú)性腺發(fā)育階段對(duì)消化酶的影響

魚(yú)體在不同的生長(zhǎng)階段，所需營(yíng)養(yǎng)成分的含量不同，隨著消化器官的相對(duì)增大，內(nèi)分泌機(jī)能的增強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝取量的增加，以及魚(yú)類各種習(xí)性的變化，消化酶活性也產(chǎn)生相應(yīng)的變化［28］。國(guó)內(nèi)外對(duì)仔、稚魚(yú)期消化酶的研究較多［29-30］，而對(duì)親魚(yú)消化酶的分布特點(diǎn)和變化規(guī)律的研究則較少。幼魚(yú)內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)期消化酶活性變化總的趨勢(shì)是隨著消化道的逐步發(fā)育而逐漸增強(qiáng)，但出現(xiàn)順序不同，隨著不同消化組織器官的分化，各種酶活性變化規(guī)律也不同。消化酶作為消化系統(tǒng)分泌的影響消化作用的酶類，其種類、特性和活力在一定程度上可以反映魚(yú)類的消化及營(yíng)養(yǎng)生理狀況，消化酶活力的高低直接影響親魚(yú)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化能力，影響性腺發(fā)育，進(jìn)而影響成熟精卵的質(zhì)量及幼體的存活率。因此，在鱘親魚(yú)性腺發(fā)育期間一定要加強(qiáng)親魚(yú)的營(yíng)養(yǎng)。

有關(guān)鱘魚(yú)消化酶的研究證明，隨著魚(yú)體的生長(zhǎng)和發(fā)育，蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均成倍數(shù)增長(zhǎng)，而脂肪酶活性的增長(zhǎng)極為顯著［31-32］。鱘魚(yú)幼魚(yú)幽門盲囊對(duì)脂肪的消化能力很低，在本試驗(yàn)中，小體鱘親魚(yú)幽門盲囊中脂肪酶活性很高，由此可見(jiàn)，此發(fā)育時(shí)期鱘親魚(yú)的幽門盲囊為脂肪消化的主要場(chǎng)所。有研究表明，在鱘魚(yú)幼魚(yú)消化酶活性中以蛋白酶活性最高，其次是淀粉酶和脂肪酶，而在本研究中，小體鱘親魚(yú)中消化酶活性與幼魚(yú)消化酶活性相似，可以認(rèn)為，在性腺發(fā)育時(shí)期的鱘親魚(yú)需要更多的蛋白和脂肪等物質(zhì)來(lái)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在鱘幼魚(yú)消化酶活性中淀粉酶的活性需求較低，雖然魚(yú)體對(duì)碳水化合物的需求量少，但是碳水化合物是必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。隨著魚(yú)體的不斷生長(zhǎng)，淀粉酶活性在不斷升高，在鱘親魚(yú)飼料中添加適量的碳水化合物有助于魚(yú)體的發(fā)育。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在小體鱘雌性親魚(yú)Ⅱ期的蛋白酶和脂肪酶活性均高于其他性腺發(fā)育時(shí)期，這可能與鱘科魚(yú)類的Ⅱ期發(fā)育在整個(gè)繁殖周期所占時(shí)間最長(zhǎng)有關(guān)，此時(shí)期是鱘魚(yú)性腺發(fā)育的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累時(shí)期。隨性腺原生質(zhì)的增長(zhǎng)，對(duì)蛋白質(zhì)的需要量最大，蛋白酶和脂肪酶活性也最高。小體鱘親魚(yú)體內(nèi)淀粉酶活性是Ⅴ期最高，此階段為鱘親魚(yú)產(chǎn)后修復(fù)階段，需要消耗碳水化合物等物質(zhì)來(lái)促進(jìn)卵巢對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。因此，在鱘親魚(yú)配合飼料中，性腺發(fā)育早期要加強(qiáng)對(duì)蛋白質(zhì)及含脂類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的補(bǔ)充。隨著鱘魚(yú)性腺的發(fā)育，從Ⅲ期到Ⅳ期為大卵黃積累期，主要是卵黃磷蛋白和磷脂類的增長(zhǎng)，對(duì)鱘親魚(yú)需要持續(xù)補(bǔ)充蛋白質(zhì)和脂類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在性腺發(fā)育Ⅴ期的脂肪酶活性也很高，所以在Ⅴ期鱘親魚(yú)飼料中也要適當(dāng)添加含脂類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，補(bǔ)充性腺發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)。有關(guān)研究證明，親魚(yú)飼料中的脂肪酸含量對(duì)親魚(yú)的產(chǎn)卵量、卵質(zhì)量和胚胎發(fā)育都有密切的關(guān)系［33］。淀粉酶的活性伴隨著性腺發(fā)育的成熟含量在不斷升高，因此，在親魚(yú)配合飼料中添加一定的碳水化合物對(duì)親魚(yú)性腺發(fā)育有很大的促進(jìn)作用。

由此可見(jiàn)，隨著性腺發(fā)育的逐漸成熟，小體鱘體內(nèi)需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量不斷增加。在鱘魚(yú)不同的生長(zhǎng)階段應(yīng)根據(jù)其消化能力的改變，適當(dāng)調(diào)整蛋白質(zhì)和碳水化合物在飼料中的比例，以提高飼料的利用率［18］。在鱘親魚(yú)性腺發(fā)育成熟時(shí)期，更要加強(qiáng)鱘親魚(yú)的營(yíng)養(yǎng)，使親魚(yú)獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提高親魚(yú)的繁殖性能，確保人工繁殖的效率。

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