基于線粒體控制區(qū)部分序列的大青鯊種群遺傳結(jié)構(gòu)研究

鄭真真，許強(qiáng)華、2，戴小杰、2，朱江峰、2

(1.上海海洋大學(xué) 海洋科學(xué)學(xué)院，上海201306;2.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部大洋漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，國(guó)家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海201306)

大青鯊Prionace glauca是一種大型中上層鯊魚，隸屬于真鯊目Carcharhiniformes、真鯊科Carcharhinidae、大青鯊屬Prionace Cantor，是3種最豐富的大洋性鯊魚之一［1］。作為一種大型的軟骨魚類，大青鯊廣泛分布于太平洋、大西洋、印度洋(簡(jiǎn)稱三大洋)海域，其分布范圍最北可達(dá)挪威，最南可達(dá)智利。大青鯊在太平洋主要分布于20°N ～20°S，在大西洋主要分布于從紐芬蘭到阿根廷的東部海域，以及從挪威到南非的西部海域［2-3］。根據(jù)大西洋金槍魚養(yǎng)護(hù)委員會(huì)(ICCAT)1990—2010年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，大青鯊在金槍魚的兼捕種類中占的比重最大，大青鯊數(shù)量正在急劇下降，已引起了ICCAT 的重點(diǎn)關(guān)注［4］。結(jié)合當(dāng)前的捕撈情況和資源現(xiàn)狀，保護(hù)大青鯊種群已成為漁業(yè)管理中一項(xiàng)重要任務(wù)。

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)呈共價(jià)閉合的環(huán)狀雙鏈，具有分子小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、嚴(yán)格遵守母系遺傳的特點(diǎn)，能有效地揭示群體內(nèi)外的遺傳變異，現(xiàn)已成為魚類分子生態(tài)學(xué)、遺傳多樣性研究的重要標(biāo)記［5-6］。線粒體控制區(qū)(D - loop)具有較高的突變和累積，是研究種內(nèi)遺傳分化的重要工具，被廣泛應(yīng)用于各物種的遺傳分化和遺傳結(jié)構(gòu)研究［7］。陳驍?shù)龋?］利用線粒體控制區(qū)對(duì)中國(guó)南部海域條紋斑竹鯊Chiloscyllium plagiosum 的遺傳多態(tài)性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，條紋斑竹鯊的基因流主要在淺海近岸水域擴(kuò)散，遺傳變異程度受地理結(jié)構(gòu)和距離隔離的影響;Mendonca等［9］采用COⅠ基因部分序列和D-loop 部分序列評(píng)估大西洋西部斜鋸牙鯊Rhizoprionodon acutus種群核苷酸的差異，結(jié)果表明，大西洋斜鋸牙鯊和加勒比斜鋸牙鯊兩個(gè)不同物種之間存在較高水平的遺傳差異;Keeney等［10］利用線粒體控制區(qū)對(duì)大西洋墨西哥灣169 個(gè)黑鰭真鯊Carcharhinus limbatus 幼體樣本的遺傳異質(zhì)性進(jìn)行了相關(guān)研究，結(jié)果表明，該海域的黑鰭真鯊并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的種群遺傳結(jié)構(gòu)。

近年來(lái)，不少學(xué)者對(duì)大青鯊的繁殖生物學(xué)特征［11］、資源狀況［12-15］、行為特性［16-18］、棲息環(huán)境［19］和生長(zhǎng)［4］等進(jìn)行了研究，為大青鯊群體的資源保護(hù)和可持續(xù)發(fā)展提供了科學(xué)資料。戴小杰等［20］對(duì)東太平洋熱帶海域大青鯊繁殖生物學(xué)特征的研究表明，大青鯊是繁殖能力很強(qiáng)的大型鯊魚之一。大青鯊為季節(jié)性的高度洄游性種類，對(duì)其的標(biāo)記回捕記錄和漁獲數(shù)據(jù)表明，南北大西洋大青鯊為同一種群。利用線粒體DNA 非編碼區(qū)序列和微衛(wèi)星標(biāo)記分析顯示，北大西洋東西部的大青鯊種群也無(wú)顯著性差異［21-23］。但迄今為止，全球范圍內(nèi)對(duì)大青鯊的遺傳多樣性以及群體遺傳結(jié)構(gòu)等方面的研究尚未見報(bào)道。本研究中，以三大洋中大青鯊的5個(gè)采樣群體為研究對(duì)象，通過(guò)分析其mtDNA 的D-loop 區(qū)部分序列，分析其遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)，并對(duì)其地理分布進(jìn)行初步探討，以期為全球大青鯊資源的合理開發(fā)、管理和保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用165 尾大青鯊成魚的肌肉組織樣本取自2010年9月—2012年2月中國(guó)科學(xué)觀察員在三大洋公海海域金槍魚延繩釣漁船的漁獲物。該船作業(yè)期間在赤道附近海域有5 個(gè)采樣位點(diǎn)，分別為中東太平洋(Central East Pacific，CEP)、中西太平洋(Central West Pacific，CWP)、西南大西洋(Southwest Atlantic，SWA)、中東大西洋(Central East Atlantic，CEA)和印度洋(Indian Ocean，INO)，采樣位點(diǎn)及采樣時(shí)間見表1。剪取大青鯊肌肉組織(約20 g)浸入無(wú)水乙醇中，于冰箱(-20 ℃)中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后保存于冰箱(-80 ℃)中備用。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 的提取 取每尾大青鯊50 ～100 mg 肌肉組織剪碎，使用組織基因組DNA 快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取大青鯊基因組DNA。用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA 的完整性，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的DNA 濃度和純度。

表1 大青鯊的采樣位點(diǎn)、采樣時(shí)間Tab.1 The sampling locations and date for blue shark Prionace glauca

1.2.2 D-loop 區(qū)基因的PCR 擴(kuò)增和測(cè)序 以大青鯊基因組DNA 為模板，隨機(jī)抽取3 個(gè)大青鯊樣本直接采用引物5' TTGGCTCCCAAAGCCAARATTCTG 3'(正向)、5'GTGGCTTAGCAAGARGTCTTG 3'(反向)(上海杰李生物技術(shù)有限公司)，擴(kuò)增出的D-loop 區(qū)基因片段長(zhǎng)約1100 bp，PCR 擴(kuò)增體系(共20 μL):Taq 聚合酶0.2 μL，10 ×buffer 2.0 μL，dNTP 1.6 μL，正反向引物各1 μL(10 pmol/μL)，模板1.0 μL，用雙蒸水ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃下預(yù)變性7 min;95℃下變性45 s，56 ℃下退火60 s，72 ℃下延伸90 s，共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下再延伸7 min，4 ℃下保存。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳分離，得到目的片段，送交生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。根據(jù)3 個(gè)樣本的測(cè)序結(jié)果，自行設(shè)計(jì)另外一對(duì)引物:PGCR -F，5' TGCACGTTAGTACCACGCTAA 3';PGCR - R，5'AACTGGCCCTACATAACCTGC 3'。擴(kuò)增出的D -loop 基因片段長(zhǎng)約700 bp，PCR 擴(kuò)增體系同上。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃下預(yù)變性3 min;95 ℃下變性30 s，55 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸60 s，共進(jìn)行30 個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下再延伸10 min，4℃下保存。送交生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，得到165 個(gè)大青鯊樣本的序列片段。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 測(cè)序結(jié)果先經(jīng)Blast 程序進(jìn)行序列比對(duì)檢索，結(jié)合DNA Star 軟件檢測(cè)其同源性，使用BioEdit 軟件進(jìn)行控制區(qū)序列的對(duì)位排列(alignment)［24］，并對(duì)序列輔以人工校對(duì)、編輯和比對(duì)，確保序列無(wú)誤。采用Mega 4.0 軟件［25］進(jìn)行序列分析，包括序列長(zhǎng)度、堿基組成和親緣關(guān)系樹的構(gòu)建，大青鯊單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建采用鄰接法(Neighbor -joining，NJ)［26-27］，序列間的遺傳距離以Kimura 雙參數(shù)法(Kimura 2 -parameter)［28］進(jìn)行估計(jì)。系統(tǒng)發(fā)育樹分支的置信度采用自引導(dǎo)法(bootstrap analysis，BP)［29］重復(fù)檢測(cè)(1000次重復(fù))。應(yīng)用DnaSP 4.0 軟件［30］計(jì)算單倍型多樣性指數(shù)(Hd)與核苷酸多樣性指數(shù)(π)。應(yīng)用Arlequin 3.0 軟件［31］進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)，其中，采用單倍型頻率計(jì)算Fst值，根據(jù)公式M=1/4(1/Fst-1)計(jì)算基因流Nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 mtDNA D－loop 區(qū)基因序列特征

經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，獲得165 個(gè)長(zhǎng)度為694 bp 的線粒體控制區(qū)(D-loop 區(qū))的堿基序列，序列中各堿基在DNA 雙鏈中平均所占的比例:A(腺嘌呤)為33.46%，T(胸腺嘧啶)為36.40%，C(胞嘧啶)為18.61%，G(鳥嘌呤)為11.53%，G+C 含量為30.14%，僅占A+T 含量的二分之一，大青鯊mtDNA D -loop 區(qū)基因片段中G 含量都比較低，平均含量為11.53%(表2)，明顯低于其他3種堿基的含量，表現(xiàn)出顯著的堿基組成偏向性。

表2 大青鯊mtDNA D－loop 區(qū)基因序列的堿基組成Tab.2 Nucleotide compositions of control region sequence of mitochondrial DNA in blue shark

2.2 遺傳多樣性和單倍型分布

在165 尾大青鯊mtDNA D-loop 區(qū)域的694 bp序列中共檢測(cè)到110 個(gè)變異位點(diǎn)，變異率為15.85%，定義145 個(gè)單倍型，分別為H1 ～H145。5 個(gè)海域的大青鯊群體mtDNA D -loop 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，165 尾個(gè)體的單倍型多樣性指數(shù)為0.997 3 ±0.001 4，核苷酸多樣性指數(shù)為0.015 10 ±0.000 91(表3)。165 尾大青鯊個(gè)體中共檢測(cè)到145種單倍型。除了CEA 群體擁有自己特有的單倍型，其他群體都擁有共享單倍型。SWA和CWP 群體同時(shí)擁有單倍型H24，而單倍型H66、H71、H76、H78、H79 同時(shí)出現(xiàn)在CWP和CEP 群體，單倍型H79、H92 同時(shí)出現(xiàn)在CEP和INO 群體(表4)。這些大量存在的共享單倍型表明，全球大青鯊群體間存在較強(qiáng)的基因交流。

表3 大青鯊群體線粒體DNA 控制區(qū)序列的遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Genetic diversity parameters of blue shark based on control region sequence data of mitochondrial DNA

表4 各采樣位點(diǎn)的大青鯊單倍型分布Tab.4 Haplotype distribution of blue shark sampled at various localities

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹

對(duì)大青鯊145 個(gè)單倍型采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示:各單倍型廣泛分布在單倍型鄰接樹上，未形成明顯的分支，不存在顯著的譜系結(jié)構(gòu)。基于線粒體DNA D-loop區(qū)構(gòu)建的單倍型間系譜關(guān)系顯示:145種單倍型只形成單一的網(wǎng)絡(luò)，各單倍型間呈現(xiàn)高水平的平行演化(由于145 個(gè)單倍型未形成明顯分支，不存在顯著譜系結(jié)構(gòu)，故圖略)。

2.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

用分子方差分析(AMOVA)法對(duì)群體間的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，99.28%的遺傳變異出現(xiàn)在種群內(nèi)，而0.72%的遺傳變異出現(xiàn)在種群間;群體間的遺傳分化指數(shù)Fst為0.007 21(表5)，說(shuō)明群體間不存在顯著的遺傳分化。

表5 大青鯊種群的分子方差分析Tab.5 AMOVA analysis of blue shark populations

利用Fst進(jìn)一步檢驗(yàn)大青鯊群體間的遺傳結(jié)構(gòu)，根據(jù)兩兩群體間的Fst值可以發(fā)現(xiàn)，所有的Fst值均較小，除SWA 群體與CEP 群體間統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)極顯著(P=0.009＜0.01)外，其他任何兩個(gè)群體間的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均不顯著(P ＞0.05)。本研究結(jié)果表明，除西南大西洋與中東太平洋的大青鯊群體間存在著顯著的遺傳分化外，其他采樣區(qū)域內(nèi)的大青鯊群體均不存在顯著的遺傳結(jié)構(gòu)。除此之外，5 個(gè)采樣點(diǎn)間大青鯊的基因交流(Nm)也比較頻繁，CWP 群體與CEA 群體間Nm最小，為11.83(表6)。

表6 采樣區(qū)域大青鯊種群間的遺傳分化分析及基因流NmTab.6 Fst analysis and Nm values of blue shark populations in various sampling regions

3 討論

大青鯊是分布最為廣泛、種群數(shù)量最多的一類大洋性鯊魚［32］，盡管大洋交界處會(huì)有不同地理種群的個(gè)體混合，但標(biāo)志重捕研究表明，大青鯊的運(yùn)動(dòng)范圍局限在其本身所在的海域，各海域間大青鯊的基因交流很少［33］。一般認(rèn)為:群體之間的Nm＜1 時(shí)，說(shuō)明群體可能由于遺傳漂變而發(fā)生了分化;而Nm＞1 時(shí)，則表明群體間的基因流水平較高，群體間遺傳分化較小;當(dāng)Nm＞4 時(shí)，表明種群間的基因交流更為充分，遺傳分化更小［34］。本研究中得到的Nm值均比4 大得多，這說(shuō)明大青鯊作為一種高度洄游的物種，它們之間的基因交流非常頻繁。根據(jù)ICCAT 的研究結(jié)果［35］，大西洋的大青鯊至少存在3 個(gè)不同的群體，分別為北大西洋、南大西洋和地中海群體。但Kohler等［21］、Shivji等［22］、Lessa等［23］根據(jù)線粒體DNA 控制區(qū)序列及微衛(wèi)星標(biāo)記分析得出，采樣區(qū)域內(nèi)北大西洋的東部和西部大青鯊種群不存在遺傳分化，這與本研究結(jié)果相符。對(duì)北大西洋和南大西洋大青鯊種群進(jìn)行的微衛(wèi)星分析，也證實(shí)了北大西洋和南大西洋種群之間存在的遺傳差異［36］。由于受到北美洲大陸的地理性隔離，北大西洋種群和北太平洋種群被認(rèn)為是兩種不同的群體。對(duì)北大西洋大青鯊的標(biāo)志重捕研究，顯示了大青鯊的季節(jié)性緯度運(yùn)動(dòng)特點(diǎn)［37-38］，釋放點(diǎn)的大青鯊向東、西兩個(gè)方向上的遷移都很常見，但跨越赤道的運(yùn)動(dòng)卻極少，結(jié)果為“北大西洋大青鯊為單一種群”這一假說(shuō)提供了證據(jù)。此外，Karl等［39］采用線粒體控制區(qū)測(cè)定技術(shù)和微衛(wèi)星技術(shù)對(duì)大西洋西部低鰭真鯊種群的遺傳關(guān)系進(jìn)行了相關(guān)研究，表明相毗鄰的種群之間沒(méi)有顯著的遺傳差異，且遺傳多樣性水平較低;Hoelzel等［40］檢測(cè)了采集自大西洋西北部、大西洋東北部、地中海、印度洋和西太平洋姥鯊Cetorhinus maximus 的mtDNA控制區(qū)的多樣性，發(fā)現(xiàn)其遺傳變異度相當(dāng)?shù)?，不同海域間沒(méi)有太大的區(qū)別。本研究結(jié)果也顯示，大青鯊種群的遺傳差異不顯著，其原因可能是由于軟骨魚類的DNA 進(jìn)化速率比其他魚類慢造成的，同時(shí)大青鯊具有生長(zhǎng)速度慢、性成熟晚、繁殖周期長(zhǎng)、繁殖率低等生物特征，而且大青鯊在大西洋中又是金槍魚延繩釣的主要兼捕對(duì)象，所以捕撈壓力對(duì)于大青鯊種群的遺傳分化造成了較大的影響。

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，是保護(hù)生物學(xué)研究的核心之一，對(duì)遺傳多樣性的研究具有重要的理論和實(shí)踐意義［41］。單倍型多樣性和核苷酸多樣性是衡量一個(gè)物種或種群線粒體DNA變異程度的兩個(gè)重要指標(biāo)［42］。Martin［43］在比較了鯊魚和哺乳動(dòng)物線粒體序列后發(fā)現(xiàn)，鯊魚的線粒體進(jìn)化速率遠(yuǎn)低于哺乳動(dòng)物和許多高等脊椎動(dòng)物，即使是公認(rèn)進(jìn)化速率最快的控制區(qū)，其進(jìn)化速率也比其他脊椎動(dòng)物低。Duncan等［44］對(duì)采自全球各大洋20 個(gè)海域的27l 尾路氏雙髻鯊Sphyrnalewini 線粒體控制區(qū)序列進(jìn)行分析時(shí)，僅發(fā)現(xiàn)22 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，24 個(gè)單倍型，表明路氏雙髻鯊線粒體DNA 變異程度較低。但本研究中對(duì)三大洋5 個(gè)海域的165 尾大青鯊線粒體D - loop 區(qū)序列進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)了110 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，145 個(gè)單倍型，分子方差分析得到Fst值為0.007 21。當(dāng)0＜Fst＜0.05 時(shí)，表明群體遺傳分化水平較弱，因此，作者認(rèn)為，大青鯊的線粒體DNA(D -loop 區(qū))具有較高的變異水平，只是由于不同群體之間強(qiáng)烈的基因交流，導(dǎo)致其遺傳分化水平較低。

迄今為止，對(duì)大青鯊種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究多數(shù)是基于標(biāo)記重捕技術(shù)開展的。利用線粒體DNA 標(biāo)記等分子手段對(duì)大青鯊種群進(jìn)行的遺傳結(jié)構(gòu)研究很少，并且僅集中在大西洋。國(guó)內(nèi)外利用線粒體DNA 標(biāo)記對(duì)印度洋和太平洋大青鯊種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究尚處于空白，這在很大程度上限制了對(duì)全球大青鯊種群遺傳結(jié)構(gòu)的全面認(rèn)識(shí)，從而影響到對(duì)大青鯊種群的有效保護(hù)和管理。本研究是首次利用線粒體D-loop 分子標(biāo)記對(duì)三大洋的大青鯊群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行的研究，為大青鯊資源的管理和保護(hù)提供了一定的理論依據(jù)。但本研究中5 個(gè)海域的采樣樣本數(shù)量相對(duì)不足，需要在今后的研究中進(jìn)一步增加采樣點(diǎn)和樣本數(shù)，以期獲得更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

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