鯉春病毒血癥病毒糖蛋白的原核表達及單克隆抗體的制備

張家林，李強，葉仕根，李華

(大連海洋大學(xué) 遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點實驗室，遼寧 大連116023)

鯉春病毒血癥(Spring viremia of carp，SVC)是由鯉春病毒血癥病毒(Spring viremia of carp virus，SVCV)引發(fā)的危害鯉科魚類的一種急性、高致死性的傳染病，目前在歐洲、美洲、亞洲廣泛傳播，現(xiàn)已造成了巨大的經(jīng)濟損失，世界動物衛(wèi)生組織(World Organisation for Animal Health，OIE)已將其列為必須申報的疾?。?］，中國在2008年頒布的動物疫病名錄中將其列為一類動物疫?。?］。近年來，國內(nèi)外很多學(xué)者致力于研究更加快速、準確地檢測SVCV 的方法。中國應(yīng)用較多的檢測方法有套式RT-PCR、熒光定量PCR、LAMP等，相關(guān)免疫學(xué)檢測方法尚未成熟［3］。而OIE 推薦的SVCV 檢測方法是建立在單克隆抗體基礎(chǔ)上的間接免疫熒光(IFA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，其中單克隆抗體具有特異性強、靈敏度高、能夠大量制備的特點，可應(yīng)用于開發(fā)各種診斷試劑，具有廣闊的應(yīng)用前景［4］，而傳統(tǒng)的制備方法是用純化病毒作為抗原制備單克隆抗體，但病毒純化程序較為復(fù)雜且很難篩選出特定抗原表位的單克隆抗體。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，用重組蛋白制備特異性單克隆抗體已成為研究趨勢。糖蛋白(G)位于SVCV 囊膜表面，是最主要的表面抗原，能夠誘導(dǎo)引起魚體產(chǎn)生中和抗體，參與病毒的感染［5］、免疫識別［6］和介導(dǎo)病毒內(nèi)吞［7］等，可作為SVCV 免疫診斷的抗原，同時也是抗病毒藥物作用的理想靶點。本研究中，選取并擴增鯉春病毒血癥病毒(簡稱為鯉春病毒，下同)G 基因片段，原核重組表達了G 蛋白，繼而制備了抗G 蛋白的單克隆抗體，并對單抗進行了初步鑒定，旨在為建立新型SVCV 免疫學(xué)診斷方法提供工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、質(zhì)粒和菌株 SVCV 0504 毒株為遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點實驗室保存菌株?？寺≥d體pMD18 - T 購于TaKaRa(大連)公司，表達載體pET-28a(+)、大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細胞由遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點實驗室保存。

1.1.2 工具酶、試劑和試驗動物 rTaq 酶、DNA Marker 購自TaKaRa(大連)公司;抗His 單抗、質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司;Bam H I 酶、Xho I 酶、T4DNA 連接酶、蛋白Marker 均購自Thermo Scientific 公司;His Bind Kits 購自Novagen 公司;胎牛血清、RPMI 1640 培養(yǎng)基、M199 培養(yǎng)基購于Hyclone 公司;HT、HAT、PEG1500、AP 標(biāo)記羊抗鼠Ig和FITC標(biāo)記羊抗鼠Ig 購自Sigma 公司;PCR 引物合成及DNA 測序由華大基因公司完成。6 ～8 周齡Balb/c小鼠購自大連醫(yī)科大學(xué)SPF 實驗動物中心，鯉春病毒陽性血清由北京檢驗檢疫技術(shù)中心贈送。

小學(xué)生思維、理解能力有限，但對新鮮事物、動態(tài)事物、鮮艷的色彩和圖案等具有強烈的好奇心和興趣。因此，教師在借助微課進行課堂教學(xué)時，應(yīng)緊緊抓住學(xué)生這一特征，將晦澀難懂的抽象知識，借助微課制作軟件，以直觀、間接的動態(tài)視頻形式展示給學(xué)生，從而激發(fā)學(xué)生的探索興趣，集中學(xué)生的注意力。

1.2 方法

1.2.1 鯉春病毒G 蛋白片段的擴增 采用Trizol法提取病毒總RNA，按照TaKaRa(大連)公司RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 產(chǎn)物作為模板。根據(jù)SVCV 0504 株G蛋白基因序列(GenBank:EU370915.1)設(shè)計擴增引物:F，5' TGGATCCTTTGTTCCATCTGGGC 3';R，5'GCTCGAGAGTTCCCCACCCACTG 3'。分別引入酶切位點Bam H I、Xho I，PCR 擴增G 基因片段(第21aa ～第463aa)。PCR 反應(yīng)條件:94 ℃下預(yù)變性5 min;94 ℃下變性30 s，51.5 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸1 min 30 s，共進行35 個循環(huán);最后在72 ℃下再延伸10 min，終止反應(yīng)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳切膠回收后，克隆至pMD18 -T 載體中，將重組質(zhì)粒pMD18 -T -G 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞中，挑選陽性克隆送華大基因公司測序，驗證插入的外源基因正確無誤。

1.2.5 雜交瘤細胞的建立 以復(fù)性蛋白免疫Balb/c 小鼠，參考李強等［8］的方法進行細胞融合，雜交瘤培養(yǎng)上清液用間接ELISA 結(jié)合間接IFA 的方法進行檢測。同時采用有限稀釋法對陽性細胞株多次克隆，直至篩選結(jié)果為100%陽性止。

經(jīng)Dot-ELISA 檢測，MAb 1C5、MAb 2D5 的細胞培養(yǎng)上清液效價分別為1∶ 2560、1∶ 5120(圖4);經(jīng)Western-Blot 檢測表明，兩株單抗與G蛋白在相對分子質(zhì)量為51 600 處結(jié)合(圖5);分泌穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，兩株雜交瘤細胞株體外連續(xù)培養(yǎng)30 d 后，可穩(wěn)定分泌抗體(圖6)。

由SVCV 引起的鯉春病毒血癥嚴重威脅中國鯉科魚類的養(yǎng)殖，而現(xiàn)階段缺乏對SVCV 有效的治療藥物，及早檢測、疫苗免疫等策略成為防控鯉春病毒血癥最有效的途徑。SVCV 主要結(jié)構(gòu)蛋白包括核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、糖蛋白(G)、RNA 聚合酶(L)，其中全長G 蛋白由509 個氨基酸組成，具有信號肽序列及跨膜結(jié)構(gòu)域，是典型的跨膜糖蛋白［9-10］，在病毒檢測、DNA 疫苗構(gòu)建上具有廣闊的應(yīng)用前景。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，重組表達外源病毒蛋白已成為研究病毒蛋白的主要手段，鯉春病毒G 蛋白已在大腸桿菌、畢赤酵母和昆蟲細胞中獲得表達［11-13］。預(yù)試驗中，構(gòu)建的全長G 蛋白重組表達質(zhì)粒在大腸桿菌中表達量過低，原因可能是全長G 蛋白含有較多疏水性氨基酸及大腸桿菌稀有密碼子，影響了G 蛋白的表達。因此，本研究中在設(shè)計引物時去掉N 端信號肽及尾部疏水區(qū)，截取G 蛋白片段，成功地實現(xiàn)了G 蛋白的高效表達，這與張琳等［11］的研究結(jié)論一致。

1.2.2 重組G 蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取pMD18 -T -G 及pET -28a(+)質(zhì)粒，分別采用限制性內(nèi)切酶Bam H I、Xho I 進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，用T4DNA連接酶于16 ℃下連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞中，挑選單菌落進行菌液PCR、雙酶切和測序鑒定，將測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET -28a(+)-G。將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中。

間接IFA 檢測方法的建立:在6 孔細胞培養(yǎng)板中進行EPC 細胞爬片，待接種病毒出現(xiàn)CPE 后傾去培養(yǎng)液，用體積分數(shù)為4%的多聚甲醛固定10 min，室溫風(fēng)干，用PBS 洗滌3次。以上述陽性雜交瘤細胞上清液為一抗，37 ℃下孵育1 h，再用PBS 洗滌3次，每次5 min，然后以FITC 標(biāo)記羊抗鼠Ig(1∶ 100)為二抗，37 ℃下孵育45 min，再用PBS 洗滌后甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察。出現(xiàn)特異的亮綠色熒光者為陽性，反之判為陰性。同時設(shè)置未感染病毒EPC 細胞作為陰性對照，鯉春病毒陽性血清為陽性對照。

間接ELISA 檢測方法的建立:以5 μg/mL 的復(fù)性蛋白作為檢測原，按照李強等［8］的方法對融合細胞上清液進行間接ELISA 檢測，設(shè)置陽性對照(免疫鼠血清)、陰性對照(空載體菌液)和空白對照(PBS)，用酶標(biāo)儀檢測OD405nm值，將P/N≥2.1 時的雜交瘤上清液判定為陽性。

(2) 有關(guān)微網(wǎng)電能質(zhì)量的關(guān)注點 微網(wǎng)內(nèi)存在逆變器型微電源和旋轉(zhuǎn)電機型微電源(微型燃氣輪機)以及大量的非線性負載,可能會造成諧波污染、電壓波動、電壓(頻率)閃變、環(huán)流等問題,所以微網(wǎng)的電能質(zhì)量問題依然是未來微網(wǎng)的研究熱點之一。

1.2.6 單克隆抗體的特性鑒定 收集細胞培養(yǎng)上清液，從1∶ 10 開始做二倍系列稀釋，采用Dot -ELISA 法測定抗體效價;表達鯉春病毒G 蛋白pET-28a -G，經(jīng)誘導(dǎo)后進行SDS - PAGE，濕法轉(zhuǎn)印后，用雜交瘤細胞上清液進行Western - Blot抗體檢測;將陽性率達100%的細胞株每隔3 d 連續(xù)培養(yǎng)30 d，取培養(yǎng)的上清液進行間接ELISA 檢測。

2 結(jié)果

2.1 G 基因片段的擴增及重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

重組表達菌株經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后，可表達相對分子質(zhì)量為51 600 左右的融合蛋白(圖2 泳道3)，而空載體誘導(dǎo)全菌、未誘導(dǎo)全菌無相應(yīng)蛋白條帶。裂解試驗說明，重組表達的G 蛋白主要以包涵體形式存在(圖2 泳道4、5)。經(jīng)優(yōu)化條件(0.4 mmol/L IPTG，37 ℃下孵育5 h)后大量表達，制備包涵體并采用親和層析柱純化(圖2 泳道6)，通過尿素梯度透析復(fù)性和Western -Blot 檢測表明，融合蛋白與抗His 單抗特異性結(jié)合，條帶大小與預(yù)測結(jié)果相一致(圖2 泳道7)，證實了目的蛋白成功表達。用Image J 軟件檢測SDS - PAGE圖譜，結(jié)果表明，復(fù)性蛋白純度達到90%。用BCA 蛋白定量試劑盒檢測，蛋白濃度約為1.0 mg/mL。

有研究者認為《蘇北女人》中的女主角令人想起女媧補天的神話故事，我非常贊同。女媧的兩個偉大創(chuàng)舉是造人和補天。柳采蓮一生養(yǎng)育了四個孩子，兩次到石宕里采石、筑屋補屋，恰與之形成對應(yīng)關(guān)系。養(yǎng)育孩子就是“造人”的隱喻，采石、筑屋可以視作“補天”的隱喻。在遠古神話中，“四極廢，九州裂，天不兼覆，地不周載，火爁焱而不滅，水浩洋而不息，于是女媧煉無色石以補蒼天”[3]284。柳采蓮們的行為是否可看作對現(xiàn)代性的“爁焱”大火造成的“天”之“裂隙”的象征性補救呢？

圖1 鯉春病毒G 基因片段擴增Fig.1 Amplification of spring viremia of carp virus(SVCV)G gene fragment

2.2 重組蛋白的表達及純化

RT-PCR 擴增后得到1326 bp 的特異性條帶，與預(yù)期大小相符，將pET -28a(+)質(zhì)粒與pMD 18 -T -G 質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，命名為pET-28a-G。經(jīng)雙酶切鑒定表明，已在pET-28a(+)質(zhì)粒中插入了一段約1326 bp的序列(圖1)，結(jié)合測序結(jié)果證明，重組表達載體構(gòu)建正確無誤。

2.3 雜交瘤細胞株的建立

采用間接ELISA 法篩選出11 株陽性雜交瘤細胞株，經(jīng)有限稀釋法克隆后收集培養(yǎng)上清液，同時制備病毒感染的EPC 細胞爬片，采用間接IFA 法進一步篩選出兩株能與病毒反應(yīng)的雜交瘤細胞株，分別命名為1C5、2D5(圖3)。

圖2 重組G 蛋白的表達Fig.2 Expression of recombinant G protein

2.4 單克隆抗體的特性分析

1.2.3 重組G 蛋白的表達及SDS -PAGE 分析挑取單菌落接種于含Kan+(40 μg/mL)的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃下震蕩培養(yǎng)過夜。以1∶ 100 比例轉(zhuǎn)接至5 mL 新鮮培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細菌對數(shù)生長期，加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L 后繼續(xù)培養(yǎng)5 h，制樣進行SDS -PAGE 電泳，分析蛋白的表達形式，并設(shè)置空載體誘導(dǎo)全菌和未誘導(dǎo)全菌為對照。同時采用濕法轉(zhuǎn)印，用1%BSA 于4 ℃下封閉過夜，用PBST 洗滌3次，每次5 min，加入用0.01 mol/L PBS 稀釋的抗His 單抗(1∶ 1000)，37 ℃下孵育1 h;用PBST 洗滌3次，每次5 min，加入用0.01 mol/L PBS 稀釋的羊抗鼠Ig(1∶ 3000)，37 ℃下孵育45 min;再用PBST 洗滌3次，每次5 min，最后加入NBT - BCIP 顯色液，以雙蒸水終止反應(yīng)。

魏樂村：斗渠長度由2 170 m變?yōu)? 605 m，比原設(shè)計增加435 m，1-1農(nóng)渠長度由850 m變?yōu)? 300 m，1-2農(nóng)渠長度由820 m變?yōu)?00 m，1-3農(nóng)渠長度由930 m變?yōu)? 700 m，1-4農(nóng)渠長度由980 m變?yōu)? 410 m，1-5農(nóng)渠長度由990 m變?yōu)? 200 m，變更后農(nóng)渠總長比原設(shè)計增加2 740 m。

3 討論

1.2.4 包涵體的純化及復(fù)性在篩選出的最佳誘導(dǎo)條件(0.4 mmoL/L IPTG，37 ℃下孵育5 h)下大量表達重組表達菌，將其超聲破碎后進行漂洗、洗滌、變性，變性蛋白按照Invitrogen His - Bind Kits 說明書進行親和層析純化。調(diào)整蛋白濃度至1 mg/mL，分別在含4、3、2、1、0.5 moL/L 尿素的復(fù)性緩沖液(50 mmol/L Tris，0.5 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl，10%甘油，1%精氨酸，pH 8.0)中進行梯度透析復(fù)性，每6 h 更換1次透析液，最后在Tris-HCl 緩沖液中透析過夜。采用SDS -PAGE 電泳檢測復(fù)性蛋白的純度，用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。

圖3 間接IFA 檢測結(jié)果Fig.3 Dection results of indirect immunofluorescence analysis(IFA)

圖4 單克隆抗體效價的測定Fig.4 Determination of 2 MAbs titer by Dot－enzyme－linked immunosorbent assay(Dot－ELISA)

圖5 單克隆抗體的特異性分析Fig.5 Specificity analysis of MAbs

pET-28a 原核表達載體功能強大，表達產(chǎn)物攜帶His 標(biāo)簽，可采用親和層析法進行純化。本研究中構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET -28a -G 時，同時轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)誘導(dǎo)，表達產(chǎn)物濃度在1 mg/mL 左右，但主要以包涵體形式存在。通常載體、宿主、外源基因和誘導(dǎo)條件等是影響外源蛋白可溶性表達的主要因素，本研究中曾更換攜帶GST 標(biāo)簽的pGS -21a(+)表達載體，更換E.coli Rosseta表達菌株，篩選表達條件(即固定其他因子，對單個因子進行不同溫度、不同IPTG 濃度和不同誘導(dǎo)時間表達)，均未明顯提高上清液表達量，較多的疏水性氨基酸與稀有密碼子成為G 蛋白的可溶表達瓶頸。

圖6 分泌穩(wěn)定性測定Fig.6 Secreting stability analysis of MAb 1C5 and MAb 2D5

包涵體經(jīng)復(fù)性后可恢復(fù)部分抗原性，楊振慧［14］制備了包涵體形式的SVCV-G 蛋白，割膠回收后免疫新西蘭大白兔，經(jīng)Western -Blot 檢測表明，制備的兔抗血清與細胞培養(yǎng)的SVCV 發(fā)生特異性反應(yīng)，這是本研究中利用包涵體形式蛋白制備單克隆抗體的理論依據(jù)。

科室學(xué)術(shù)例會是培養(yǎng)研究生科研水平的一種重要手段，其主要內(nèi)容是工作匯報，實驗交流和科學(xué)問題探討[6]。還可以利用研究課題方向相近的特點，在有限范圍內(nèi)建立課題小組。通過課題組定期組會制度對研究生文獻檢索能力進行培養(yǎng)和考核。對于剛?cè)雽W(xué)或剛進實驗室的研究生，主要匯報所查閱的文獻，通過相互的交流和討論，確定研究生的具體課題方向；對于高年級研究生，則著重匯報自己課題的進展情況以及遇到的問題，通過查閱文獻如何解決[7]。

張朋等［15］利用純化病毒制備抗鯉春病毒單克隆抗體，經(jīng)Western -Blot 檢測表明，制備的單抗主要識別SVCV N 蛋白，這可能與N 蛋白是病毒粒子中含量最豐富的蛋白有關(guān)。若用全病毒抗原制備單克隆抗體，難以篩選出與鯉春病毒G 蛋白反應(yīng)的單抗，而本研究中以重組蛋白制備抗SVCV G 蛋白的單抗，則無需進行復(fù)雜的病毒純化。為保證篩選結(jié)果的準確性，本研究中建立了間接ELISA 結(jié)合間接IFA 的篩選方法，前者可一次性處理大批樣品以縮小篩選范圍，后者可確保具有特異性的單抗與病毒反應(yīng)。結(jié)果表明，本研究中成功篩選出兩株陽性的雜交瘤細胞株，經(jīng)Western -Blot 檢測表明，兩株單抗能與SVCV G 蛋白反應(yīng)，具有良好的特異性。

蘇霍姆林斯基說過：“教育的全部奧妙就在于愛兒童?！碧招兄壬舱f過：“捧著一顆心來，不帶半根草去?！币虼?，愛是一種力量、一種品質(zhì)，是教育成功的秘訣。在德育工作中，愛是基礎(chǔ)，愛是本質(zhì)，愛是師德的核心，愛是教師最基本的行為準則和道德準則。在德育工作中，如何讓學(xué)生在師愛中快樂學(xué)習(xí)、健康成長、全面發(fā)展呢?

本研究中，采用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)地實現(xiàn)了鯉春病毒G 蛋白的高效表達，經(jīng)包涵體洗滌、親和層析純化后，采用尿素濃度梯度復(fù)性，首次以重組蛋白制備出抗鯉春病毒G 蛋白的單克隆抗體，為進一步建立新型SVCV 快速檢測方法提供了技術(shù)支持。

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