急性溫度脅迫對虹鱒肝臟代謝酶活性及生長相關(guān)基因表達(dá)的影響

管標(biāo)，溫海深，劉群，王金環(huán)，王慶龍

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東 青島266003)

變溫動物的生長、代謝、發(fā)育等都受到環(huán)境溫度的影響，在可能的情況下魚類總是選擇在最適宜的環(huán)境中生存。許多魚類會通過降低代謝速率和生長速度來應(yīng)對較低溫度，而溫度迅速升高后，魚類又會很快達(dá)到耐受范圍，但只能存活很短的時間。溫度驟變是魚類在運輸、養(yǎng)殖生產(chǎn)甚至自然條件下都可能面臨的脅迫，能抑制魚類的攝食、生長，從而對魚類的生理適應(yīng)和代謝產(chǎn)生重大影響［1］。

魚類通過內(nèi)分泌系統(tǒng)來調(diào)節(jié)新陳代謝和生長，以應(yīng)對環(huán)境的變化和不同的生長階段［2］。與許多高等脊椎動物一樣，魚類生長發(fā)育很大程度上也是通過生長激素(GH)——類胰島素樣生長因子(IGF)軸進(jìn)行調(diào)控的［3］。生長激素能夠調(diào)控機體的生長、免疫、代謝、滲透調(diào)節(jié)等多種行為，并通過靶組織與生長激素受體(GHR)結(jié)合發(fā)揮生理作用［4］。生長激素存在兩種受體，即GHR1和GHR2，在多種魚中均有發(fā)現(xiàn)，并且在大多數(shù)組織中廣泛表達(dá)［5］。GH 對生長的促進(jìn)作用直接或間接地通過IGFs 來實現(xiàn)，包括IGF-1和IGF-2，IGFs具有胰島素類似物的作用，同時又可促進(jìn)個體的細(xì)胞分化與增殖［6］。其中，IGF -1 通過自分泌和旁分泌作用在多個器官內(nèi)產(chǎn)生，但主要在肝臟內(nèi)合成［7］，通過血液運送到各個組織，促進(jìn)細(xì)胞的分裂和分化，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，抑制蛋白質(zhì)的降解，促進(jìn)機體生長［8］。Shepherd等［9］研究發(fā)現(xiàn)，海水養(yǎng)殖羅非魚Oreochromis mossambicus 腦垂體中的GH 升高，血漿中IGF-1 基因表達(dá)水平也升高。而IGF-2在魚類新陳代謝中的作用尚不清楚。在哺乳動物中，IGF -2 基因表達(dá)主要是在胚胎發(fā)育階段［10］，而Reinecke等［11］研究發(fā)現(xiàn)，IGF-2在幼魚和成魚體內(nèi)均有廣泛的表達(dá)。IGF-2和IGF-1 有較高的同源性，在魚類的不同組織中二者的基因表達(dá)受到GH 的調(diào)控［12］，Chen等［13］試驗證明，IGF-1和IGF-2 均可刺激羅非魚快速生長。

血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)是聯(lián)系蛋白質(zhì)代謝和糖代謝的重要氨基轉(zhuǎn)移酶，是檢測肝臟功能是否正常的重要指標(biāo)。正常情況下，AST和ALT 主要存在于肝臟和其他組織的線粒體內(nèi)，只有少量被釋放到血漿中，因此，血清中的ALT 活性較?。?4］。堿性磷酸酶(ALP)是一種在生物界中分布廣泛的磷酸酯酶，通常分布于溶酶體內(nèi)，在溶酶體外的胞漿基質(zhì)內(nèi)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)也有少量分布。ALP 的主要生理功能是參與磷及磷酸酯的代謝調(diào)節(jié)，同時還參與調(diào)節(jié)機體代謝、鈣磷比例和機體信號傳導(dǎo)等許多生理活動［15］。而關(guān)于這些生理學(xué)指標(biāo)對溫度脅迫響應(yīng)機制的研究目前鮮有報道。

虹鱒Oncorhynchus mykiss 隸屬于鮭形目Salmoniformes、鮭科Salmonidae、大馬哈魚屬Oncorhynchus，為冷水性優(yōu)良養(yǎng)殖品種。但虹鱒生活溫度適宜區(qū)間小，其適宜生長水溫為12 ～18 ℃［16］，這對虹鱒的養(yǎng)殖和運輸?shù)榷紩a(chǎn)生不利影響。本研究中，進(jìn)行了高溫和低溫脅迫對虹鱒血清中轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST和ALP 活性的影響以及對血清IGF -1激素含量變化的試驗研究，同時分析了急性溫度脅迫對虹鱒GHR1、IGF -1和IGF -2 mRNA表達(dá)的影響。通過該項研究，探究急性溫度脅迫對虹鱒生理適應(yīng)及代謝機制的影響，尤其是對其肝臟功能的危害程度，旨在豐富魚類生理學(xué)內(nèi)容，為魚類運輸與養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用虹鱒共135 尾，于2012年3月采自山東濰坊某養(yǎng)殖場，試驗魚健康活潑，為同一批次卵孵化。試驗開始時虹鱒體質(zhì)量為(240 ±18)g，體長為(25.7 ±1.7)cm。

試驗用儀器和試劑主要有:BS -180 生化分析儀，由深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司生產(chǎn);ALT、AST、ALP 試劑盒均購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;IGF -1 試劑盒購自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物有限公司;RNAiso Reagent 試劑、Taq 酶、DNaseⅠ(RNasefree)、RNasin、RNA 酶和SYBR Premix Ex Taq 均購自TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗條件與飼養(yǎng)管理 試驗于2012年4月在中國海洋大學(xué)魚類生理與繁育實驗室全循環(huán)水系統(tǒng)中進(jìn)行，試驗魚在循環(huán)水系統(tǒng)中暫養(yǎng)馴化2 周，暫養(yǎng)及試驗期間全循環(huán)流水，連續(xù)充氣，溫度為(16 ±1)℃，pH 為7.8 ～8.1，溶解氧(DO)＞6 mg/L。試驗期間，虹鱒的投喂量和投喂方式與馴化期間相同，每天8:00和16:00 飽食投喂鱘魚配合飼料。

1.2.2 試驗設(shè)計與樣品采集 試驗設(shè)計1 個對照組和2 個處理組，分別為A 組(常溫對照組，水溫為16 ℃)、B 組(低溫處理組，水溫為6 ℃)、C 組(高溫處理組，水溫為24 ℃)，每組溫度變化在1 ℃以內(nèi)。每個處理組設(shè)3 個平行，每個平行放5 尾魚，共45 尾魚。將馴化后的虹鱒放入2 個處理組中熱應(yīng)激2 h，再放入正常養(yǎng)殖的循環(huán)水系統(tǒng)中恢復(fù)。分別在恢復(fù)0、6、12、24、48 h 時采樣，每個試驗組每次采樣3 尾。

采樣前將試驗魚放入MS -222 麻醉劑(40 ～45 g/L)中麻醉，以減少采樣操作等對試驗的影響。從魚尾靜脈采血，將采集的血液放于冰箱(4℃)中靜置4 ～6 h 后，以12 000 r/min 離心15 min，提取血清并置于超低溫冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆?。采集完血樣后迅速解剖試驗魚，取新鮮的肝臟組織于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ALT、AST和ALP 活性的測定 采用BS -180 生化分析儀測定血清中ALT、AST和ALP 活性。

1.2.4 IGF-1 激素含量的測定 采用放射性同位素(125I)標(biāo)記的放射免疫法(RIA)測定血清中IGF-1 激素含量。根據(jù)IGF-1 試劑盒說明書并結(jié)合本實驗室條件進(jìn)行改進(jìn)，采用半量法進(jìn)行測定，每個樣品設(shè)置2 個平行。

1.2.5 實時定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以及目的基因的定量測定 根據(jù)Flores等［17］的方法設(shè)計GHR-1 實時定量表達(dá)引物。根據(jù)NCBI 已經(jīng)克隆得到的IGF -1(M95183.1)和IGF -2(M95184.1)cDNA 的序列，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計實時定量表達(dá)。表達(dá)所需的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。具體引物如表1所示。

對樣品cDNA 進(jìn)行4 倍梯度稀釋，以稀釋后的cDNA 為模板進(jìn)行實時定量PCR，每個模板設(shè)3 個平行。PCR 反應(yīng)體系(共20 μL):SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板2 μL，ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)條件:95 ℃下預(yù)變性1 min;95 ℃下變性10 s，相應(yīng)基因退火溫度下退火40 s，72 ℃下延伸40 s，共進(jìn)行40 個循環(huán)。實時連續(xù)測定擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的熒光，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 虹鱒GHR-1、IGF-1、IGF-2和18 S 基因表達(dá)所用引物Tab.1 Primers used in expression of GHR -1，IGF -1，IGF-2 and 18 S genes in rainbow trout Oncorhynchus mykiss

對樣品中的cDNA 進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立一致，每個樣品設(shè)3 個重復(fù)。根據(jù)實時熒光定量PCR 的結(jié)果，以18 S 為內(nèi)參基因，根據(jù)目的基因以及18 S 的Ct值，按照2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表達(dá)。采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和鄧肯多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性溫度脅迫對虹鱒血清中AST、ALT和ALP 活性的影響

溫度脅迫2 h 后，虹鱒血清中AST 活性在低溫和高溫兩個處理組中的變化趨勢相同，在脅迫后恢復(fù)0 h 時均略有升高，恢復(fù)6 h 時達(dá)到最大值，且與對照組有顯著性差異(P＜0.05);恢復(fù)12 h 后，AST 活性逐漸降低并恢復(fù)至接近對照組水平(圖1 -A)。

高溫處理組的ALT 活性變化趨勢與AST 相同;而低溫處理組在脅迫后恢復(fù)0 h 時就顯著升高(P＜0.05)，隨后逐漸降低至對照組水平(圖1 -B)。

低溫處理組的ALP 活性，在溫度脅迫后恢復(fù)6 h 時后均顯著低于對照組(P＜0.05);而高溫組的ALP 活性在溫度脅迫后雖有所降低，但與對照組無顯著性差異(P ＞0.05)(圖1 -C)。

圖1 溫度脅迫后虹鱒血清中AST、ALT和ALP 活性的變化Fig.1 Changes in serum activities of AST，ALT and ALP in rainbow trout exposed to acute temperature stress

2.2 急性溫度脅迫對虹鱒血清中IGF -1 激素含量的影響

溫度脅迫對虹鱒血清IGF -1 含量有顯著的影響。從圖2可見:溫度脅迫后恢復(fù)0 h 時，兩個處理組血清IGF-1 含量均急劇降低，且與對照組有顯著性差異(P＜0.05);低溫處理組血清IGF -1含量在整個試驗過程中均處于較低水平，恢復(fù)6、12、48 h 時與對照組有顯著性差異(P＜0.05);而高溫處理組血清IGF -1 含量在12 h 后逐漸恢復(fù)，在48 h 時達(dá)到對照組水平。

2.3 急性溫度脅迫對虹鱒肝臟GHR1、IGF-1和IGF-2 mRNA表達(dá)的影響

急性溫度脅迫對3種基因表達(dá)有不同程度的影響。對于GHR1 基因，低溫和高溫處理組mRNA表達(dá)量均有減少，但與對照組無顯著性差異(P ＞0.05)，整個試驗過程中GHR1 mRNA表達(dá)量處于較穩(wěn)定水平(圖3 -A)。

圖2 溫度脅迫后虹鱒血清中IGF-1 含量的變化Fig.2 Changes in serum IGF-1 level in rainbow trout exposed to acute temperature stress

圖3 溫度脅迫后虹鱒肝臟中GHR1、IGF-1和IGF-2 mRNA表達(dá)量的變化Fig.3 Changes in GHR1，IGF -1，and IGF -2 mRNA expression in liver of rainbow trout exposed to acute temperature stress

對于IGF-1 基因，低溫處理組mRNA表達(dá)量在整個試驗過程中有所降低，但與對照組無顯著性差異(P ＞0.05);而高溫處理組IGF -1 mRNA表達(dá)量在恢復(fù)6、12 h 時顯著低于對照組(P＜0.05)，12 h 后逐漸恢復(fù)至對照組水平(圖3-B)。

對于IGF -2 基因，溫度脅迫后恢復(fù)0 h 時，兩個處理組mRNA表達(dá)量都急劇下降，高溫組與對照組有顯著性差異(P＜0.05)，且在整個試驗過程中均顯著低于對照組(P＜0.05)，其中高溫處理組的下降程度大于低溫處理組(圖3 -C)。

3 討論

ALT和AST是兩種重要的轉(zhuǎn)氨酶。正常情況下兩種酶多存在于細(xì)胞的線粒體中，其中尤以肝臟中含量豐富，而血清中活性很低。當(dāng)機體受到損害時，細(xì)胞膜的通透性會發(fā)生改變，故胞漿酶釋放較多，導(dǎo)致血液中ALT和AST 活力明顯升高。Vaglio等［18］給金頭鯛Sparus aurata 注射劑量為2.5 mg/kg(體質(zhì)量)的CdCl2，6 d 后血液中的AST和ALT活性顯著升高;Dela Torre等［19］將鯉Cyprinus carpio幼魚暴露在半致死劑量(1.5 ～1.7 mg/L)的Cd溶液中14 d 后，鯉肝臟中的AST和ALT 活性顯著升高，表明Cd 暴露對鯉肝臟已造成損傷。本試驗中，虹鱒血清中的ALT和AST 活性都在恢復(fù)6 h時有顯著升高，表明急性溫度脅迫對虹鱒的肝臟產(chǎn)生了破壞作用;24 h 后，隨著機體的恢復(fù)，兩種酶活性逐漸降低。ALP在生物體內(nèi)能夠直接參與調(diào)節(jié)磷代謝，保持體內(nèi)鈣磷比例相對穩(wěn)定，同時還能夠參與蛋白的分泌和脂質(zhì)代謝等，是一種重要的代謝調(diào)控酶［20］。魚類處于應(yīng)激狀態(tài)時，如饑餓、溫度脅迫等，將影響血清中ALP 的活性［21］。本試驗中，溫度脅迫后低溫和高溫兩個處理組虹鱒血清中的ALP 活性均有降低，表明虹鱒體內(nèi)代謝受到溫度脅迫的影響，且隨著常溫恢復(fù)過程，ALP 活性有升高趨勢。

魚類的生長受到“下丘腦- 垂體- 肝臟軸”的調(diào)控，GH是促進(jìn)機體生長的主要激素。但單獨的GH 不能促進(jìn)魚類的生長，IGF-1是GH 發(fā)揮促生長作用的重要中介因子。Bolton等［22］研究發(fā)現(xiàn)，直接給虹鱒注射一定劑量的GH 對其生長無促進(jìn)作用;而McComick等［23］研究發(fā)現(xiàn)，給大西洋鮭Salmo salar 注射豬的IGF -1 后，其生長率能快速提高。許多作者都有報道，有害刺激對于魚類的生長有較強烈的消極影響。捕撈和禁閉暫養(yǎng)刺激會影響到虹鱒血液中GH、IGF -1和IGF -2 的含量，導(dǎo)致其血液中激素含量降低，從而抑制魚類正常生長［24］。溫度脅迫也會影響羅非魚的攝食與代謝，Bradley等［25］研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚的GH 存在耐受機制，IGF-1 迅速降低，而GH 變化較慢。本試驗中，急性溫度脅迫后，兩個處理組的血清IGF-1含量均顯著降低，且在整個試驗過程中均低于對照組，虹鱒生長相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量也受到溫度的影響，且通常與激素含量的變化相對應(yīng)。

GH是促進(jìn)生長的主要基因，而GH 發(fā)揮作用需要GHR 介導(dǎo)。Ayson等［26］研究發(fā)現(xiàn)，饑餓和恢復(fù)投喂能使點斑藍(lán)子魚Siganus guttatus GH mRNA表達(dá)量略有降低;Matejka［27］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腎臟和肝臟受損后，GHR mRNA 水平顯著減少。本試驗中，溫度脅迫后兩個處理組GHR1 mRNA表達(dá)量均略有降低，這與Bradley等［25］對尼羅羅非魚Oreochromis niloticus 禁食和投喂試驗結(jié)果相類似。這也從另一方面表明，血清GH 含量可能減少。對許多魚的研究發(fā)現(xiàn)，IGF -1 mRNA在很多組織中都有表達(dá)，其中肝臟中表達(dá)最豐富［28］，這表明肝臟對于IGF-1 的合成和分泌起著重要作用。IGF -1的表達(dá)量受到很多環(huán)境因素的影響，Duan［29］研究表明，海鯛Pagrosomus major 較少的攝食量將導(dǎo)致IGF-1 mRNA 水平下降;Larsen等［30］研究發(fā)現(xiàn)，低溫處理下銀大麻哈魚Oncorhynchus kisutch 的IGF-1 mRNA 水平明顯降低。本研究中，急性溫度脅迫后，虹鱒肝臟中IGF -1 mRNA 的表達(dá)量有所降低，其中高溫脅迫后恢復(fù)6 h 時顯著低于對照組，直到24 h 時才恢復(fù)到接近對照組水平。虹鱒屬冷水性魚類，低溫脅迫時，虹鱒通過降低代謝速率、減少攝食等維持機體功能，生長速度減少較慢;而高溫脅迫能快速達(dá)到虹鱒的耐受限度，生長速度急速下降。許多硬骨魚的IGF -2 不僅在肝臟中表達(dá)豐富，而且在許多其他器官如腦、心臟、腎臟、肌肉等中都有很高的表達(dá)量［27］。快速生長的斑點叉尾鮰Ictalurus punctatus 肝臟和肌肉中的IGF-2 mRNA表達(dá)量，比慢速生長的斑點叉尾鮰更高，這表明IGF -2在魚類生長中起重要作用［31］。本試驗中，與GH和IGF -1 相比，肝臟中IGF -2 mRNA 水平下降更明顯，這說明肝臟中IGF - 2 mRNA 水平更易受到水溫等環(huán)境變化的影響。

總之，急性溫度脅迫對虹鱒血清中ALT、AST和ALP 活性有不同程度的影響，這說明急性溫度脅迫對虹鱒的代謝產(chǎn)生了影響。血清IGF -1 激素含量的變化以及GHR1、IGF -1和IGF -2 mRNA表達(dá)量的變化，都說明急性溫度脅迫對虹鱒生長產(chǎn)生了不良的影響。高、低溫處理組虹鱒的不同變化，表明了冷水魚類對高溫脅迫更敏感，本試驗也可為虹鱒的運輸及養(yǎng)殖條件優(yōu)化提供參考。

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