雛番鴨沙門氏菌的分離與鑒定

陳紅梅 程龍飛 傅光華 施少華 萬春和 傅秋玲 黃瑜

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心 福州 350013）

雛番鴨沙門氏菌的分離與鑒定

陳紅梅 程龍飛 傅光華 施少華 萬春和 傅秋玲 黃瑜＊

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心 福州 350013）

2014年10月，福建某番鴨場因患疑似鴨沙門氏菌病導(dǎo)致雛番鴨大量死亡，為確診雛番鴨死亡原因，對送診的死亡雛番鴨進(jìn)行細(xì)菌分離、生化鑒定和針對沙門氏菌fimW基因作PCR鑒定，并對分離菌進(jìn)行藥敏試驗以及動物回歸試驗，試驗結(jié)果表明：引起雛番鴨死亡的原因是鴨沙門氏菌病。

雛番鴨 沙門氏菌 分離鑒定

鴨沙門氏菌病又稱為鴨副傷寒，是由鼠傷寒等幾種沙門氏菌所引起的疾病總稱，主要引起雛鴨發(fā)病，發(fā)病雛鴨多呈急性或亞急性經(jīng)過，引起大批死亡，成年鴨則常為慢性經(jīng)過或耐過[1]。2014年10月，福建某番鴨場因患疑似鴨沙門氏菌病導(dǎo)致雛番鴨大量死亡，死亡番鴨的病變表現(xiàn)為心包炎，肝臟腫大，腸黏膜壞死，盲腸腫脹，內(nèi)有栓子。為確診雛番鴨死亡原因，對送診的死亡雛番鴨進(jìn)行細(xì)菌分離、生化鑒定和針對沙門氏菌fimW基因作PCR鑒定，并對分離菌進(jìn)行藥敏試驗以及動物回歸試驗。

1 材料與方法

1.1 病料樣品病料樣品來源于福建省某番鴨場的病死雛番鴨。

1.2 主要試劑細(xì)菌生化反應(yīng)管與藥敏試紙均購自杭州天和微生物試劑有限公司；其他試劑均為分析純；普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基以及普通肉湯自制。

1.3 試驗動物試驗動物為購置健康鴨場1日齡的雛番鴨。

1.4 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與純化無菌條件下取死亡雛番鴨的肝臟接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24 h后取出，挑取其中單一的菌落進(jìn)行純化，再將純化后的菌落于普通肉湯中37℃、150 r/min進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。

1.5 革蘭氏染色鏡檢采用常規(guī)方法進(jìn)行革蘭氏染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.6 生化試驗挑取純培養(yǎng)的單菌落接種細(xì)菌生化微量鑒定管，37℃培養(yǎng)24 h觀察生化試驗結(jié)果。

1.7 藥敏試驗采用紙片擴散法，檢測分離菌株對18種常用抗菌藥物的敏感性。判斷標(biāo)準(zhǔn)參照中國藥檢所制定的標(biāo)準(zhǔn)。

1.8 動物回歸試驗購進(jìn)1 d健康雛番鴨20羽，飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行試驗。隨機選取10羽通過腿部肌肉注射0.2 mL/羽（4.5×109CFU/mL）分離菌肉湯培養(yǎng)液，另外10羽注射等量的生理鹽水作為試驗對照。每天觀察兩次并記錄其發(fā)病情況。雛番鴨發(fā)病死亡后剖檢觀察，記錄其病理變化，同時在無菌條件下取死鴨肝臟接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離與培養(yǎng)特性觀察普通營養(yǎng)瓊脂上長出細(xì)小、濕潤、半透明的菌落，SS培養(yǎng)基上長出黑色小菌落，而麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上長出無色、透明、圓形、光滑、針尖大小的菌落。經(jīng)革蘭氏染色后，鏡下觀察可見分離菌為革蘭氏陰性、無芽孢、無莢膜小桿菌。2.2生化試驗所分離的細(xì)菌使葡萄糖、甘露醇、阿拉伯糖均發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不發(fā)酵乳糖、蔗糖、麥芽糖，產(chǎn)生硫化氫，不產(chǎn)生吲哚，枸櫞酸鹽與甲基紅試驗陽性，V-P試驗為陰性（見表1）。這些與沙門氏菌的生化特性相符。94℃30 s、53℃30 s、72℃45 s，35個循環(huán)；72℃10 min。取PCR產(chǎn)物5 μL，在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察拍照。將PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化后與載體pMD18-T連

表1 分離菌的生化反應(yīng)結(jié)果

2.3 藥敏試驗該分離菌對慶大霉素、頭孢唑啉、氧氟沙星、壯觀霉素、丁胺卡那高敏；對恩諾沙星、氟哌酸、環(huán)丙沙星、卡那霉素、羅紅霉素、新霉素中敏，對氨芐青霉素、阿莫西林、復(fù)方新諾明等低敏。見表2。

表2 分離菌藥敏試驗結(jié)果

2.4 PCR鑒定參照文獻(xiàn)[2]合成一對可特異性擴增沙門氏菌fimW基因的引物。

上游引物：5'-AACAGTCACTTTGAGCATGGGTT-3'；下游引物：5'-GAGTGACTTTGTCTGCTCTTCA-3'。

預(yù)期擴增片段為477 bp，該引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

用常規(guī)方法提取分離菌的DNA，用所設(shè)計的特異性引物進(jìn)行PCR擴增，擴增體系為50 μL，其中2×GoTaq Master Green Mix 25 μL、上下游引物（20 μm/mL）各1 μL、DNA模板1μL，補充滅菌去離子水至總體積50 μL。反應(yīng)程序是94℃5 min；接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用PCR方法鑒定重組質(zhì)粒，陽性重組質(zhì)粒送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定。

圖1 分離菌PCR電泳結(jié)果（注：M.Marker(DL2000)；1.分離菌；2.鴨疫里默氏菌；3.大腸桿菌；4.空白對照）

2.5 動物回歸試驗接種7 h后試驗組雛番鴨開始出現(xiàn)死亡，26 h內(nèi)試驗組雛番鴨全部死亡，而對照組雛番鴨健康。剖檢死亡番鴨，可見肝臟腫大、表面有灰白色壞死點，盲腸腫大，并從死亡番鴨的肝臟中重新分離到該菌。

3 討論與小結(jié)

1）鴨沙門氏菌病主要引起3周齡以下的雛鴨（尤其是10日齡內(nèi)的）發(fā)病，屬于一種急性和慢性傳染病，急性常呈地方流行，鴨沙門氏菌病屬于人畜共患病，具有重要公共衛(wèi)生意義[1-3]。

2）本試驗對送診的病死鴨進(jìn)行了細(xì)菌分離及實驗室診斷，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)性狀觀察、生化反應(yīng)以及PCR鑒定和動物回歸試驗，引起該番鴨場大批雛番鴨死亡的病因為鴨沙門氏菌病。

3）目前由于抗生素使用過量，沙門氏菌普遍存在耐藥性，應(yīng)當(dāng)參照藥敏試驗的結(jié)果選擇敏感的藥物進(jìn)行對癥治療，最大限度地減少養(yǎng)殖戶的損失。本試驗所分離的沙門氏菌對慶大霉素、頭孢唑啉、氧氟沙星、壯觀霉素、丁胺卡那高敏；對恩諾沙星、氟哌酸、環(huán)丙沙星、卡那霉素、羅紅霉素、新霉素中敏，對氨芐青霉素、阿莫西林、復(fù)方新諾明等低敏。

4）應(yīng)用PCR方法對鴨沙門氏菌病進(jìn)行快速診斷，可大大縮短實驗室診斷的時間，加快對疾病的診斷，提供準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。

5）對于沙門氏菌病的防治，主要做好以下兩點：首先嚴(yán)格做好孵化場的衛(wèi)生，保證防止種蛋孵化過程被污染，在源頭上切斷沙門氏菌的污染；其次做好鴨場的衛(wèi)生，確保鴨場通風(fēng)和干燥，及時隔離患鴨[1-3]。

[1]陳伯倫,陳育濠,陳偉斌,等.鴨病[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2008.

[2]張江英,董立偉,王小舟,等.針對fimW基因沙門氏菌的特異性PCR檢測[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2013,35(10):837-839.

[3]王傲雪,張凌云,張桉潮,等.肉雞沙門氏菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國畜牧獸醫(yī),2013,40(7):167-171.

Isolation and identification of Salmonella from Muscovy ducklings

Chen Hongmei Cheng Longfei Fu Guanghua Shi Shaohua Wan Chunhe Fu Qiuling Huang Yu*
（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Fujian Academy of Agricultural Science; Fujian Animal Disease Control Technology Development Center,Fuzhou 350013）

In October 2014,a high mortality of Muscovy ducklings occurred in a Muscovy duck farm of Fujian.To identify the pathogen,a sample is taken from dead Muscovy duckings suspected to be Salmonellosis.The pathogenic isolate was identified to be Salmonella based on physiological and biochemical tests and amplifications of fimW(477 bp)gene and animal regression experiment. The test results show that the cause of death of the Muscovy duck is salmonellosis.

Muscovy ducklings Salmonella Isolation and identification

A

1003-4331（2014）06-0001-03

陳紅梅（1979-），碩士，助理研究員，從事畜禽傳染病研究。E-mail:chenhmei052@126.com。

＊通信作者：黃瑜（1965-），博士，研究員，從事畜禽傳染病研究。E-mail:huangyu_815@163.com。