超聲萃取-高效液相色譜法同時測定奶粉中4 種雌激素類殘留

譚 芳，黃 璐，鄭 琦

（江漢大學(xué) 光電化學(xué)材料與器件省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430056）

現(xiàn)代牛奶中的雌激素包括內(nèi)源性雌激素，即奶牛本身產(chǎn)生的雌激素，和外源性雌激素，即應(yīng)用于奶牛的雌激素，主要與孕激素等一起誘導(dǎo)奶牛發(fā)情和泌乳。牛奶中所含雌激素如果過高，可能導(dǎo)致兒童性早熟，成年人發(fā)生乳腺或者婦科腫瘤以及前列腺癌[1-2]。因此，快速準(zhǔn)確檢測牛奶制品中雌激素對于估計食品安全的潛在因素是很必須的。目前，國家出臺的標(biāo)準(zhǔn)中[3-4]，僅對牛奶中的雌激素建立了檢測方法，而奶粉的檢測方法尚無現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)。由于奶粉配方基質(zhì)復(fù)雜，激素殘留量低，建立快速、準(zhǔn)確的方法來解決奶粉中的雌激素檢測問題很有必要。目前國內(nèi)外測定牛奶制品中激素的文獻(xiàn)較多[5-12]，但測定其中壬基酚及苯甲酸雌二醇等雌激素殘留的報道卻較少[13-15]。本研究建立了一種超聲萃取-高效液相法可以快速、靈敏、準(zhǔn)確同時測定奶粉中炔雌醇、己烯雌酚、壬基酚和苯甲酸雌二醇的雌激素殘留。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

孕婦奶粉、嬰幼兒1、2階段配方奶粉、中老年營養(yǎng)奶粉 市購；對照品己烯雌酚（批號F1219049）、苯甲酸雌二醇（批號45131） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；炔雌醇（批號10408）、壬基酚（批號70924） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈（色譜純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鈉（分析純） 天津博迪化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DIONEX高效液相色譜儀（GP50型梯度泵、TCC-100柱溫箱、UVD170U型紫外檢測器） 美國戴安公司；kQ-250超聲波提取儀 昆山市超聲儀器有限公司；微孔濾膜（孔徑0.45 μm） 天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；800型低速離心沉淀機(jī) 中國深圳國華儀器；DENVER電子天平 美國丹佛儀器公司；離心管（10 mL，具塞帶刻度） 湖南長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

稱取2.0 g奶粉試樣于10 mL具塞刻度離心管中，加4 mL乙腈混勻，超聲提取20 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液靜置，重復(fù)3 次，合并上清液，40 ℃條件下氮氣吹至近干，殘余物用乙腈溶解并定容至1 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，以高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取炔雌醇、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、壬基酚對照品各50 mg，用乙腈定容至50 mL，得到質(zhì)量濃度1 mg/mL的貯備液，存放于冰箱備用。準(zhǔn)確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，用乙腈稀釋，配制成一系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Thermo C18柱（250 mm×0.46 mm，5 μm）；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；流動相：乙腈∶（0.043 mol/L）磷酸二氫鈉緩沖液（用磷酸調(diào)至pH值到5）；梯度洗脫：1～5 min，V（乙腈）∶V（磷酸二氫鈉緩沖液）=55∶45，5～15 min，V（乙腈）∶V（磷酸二氫鈉緩沖液）=85∶15，15 min后V（乙腈）∶V（磷酸二氫鈉緩沖液）=55∶45；檢測波長224 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的選擇

[16-19]，本實驗選擇甲醇、乙腈、水、磷酸二氫鈉等不同溶劑及不同配比的多種溶劑體系進(jìn)行了一系列實驗，甲醇作為流動相有機(jī)相時基線不穩(wěn)定，干擾較大，選用乙腈后基線較穩(wěn)定。水作為流動相，苯甲酸雌二醇易出現(xiàn)肩峰或雙頭峰，選擇磷酸二氫鈉緩沖液作為流動相，可改善此現(xiàn)象，峰形較好，且分離效果更好。本實驗還進(jìn)行了等度洗脫和梯度洗脫的研究。結(jié)果表明，流動相為乙腈-（0.043 mol/L）磷酸二氫鈉緩沖液（用磷酸調(diào)至pH值到5）；梯度洗脫：1～5min，V（乙腈）∶V（磷酸二氫鈉緩沖液）=55∶45，5～15 min，V（乙腈）∶V（磷酸二氫鈉緩沖液）=85∶15，15 min后，V（乙腈）∶V（磷酸二氫鈉緩沖液）=55∶45時，分析時間適宜且各組分分離度較好。

2.2 波長的選擇

對己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、壬基酚和炔雌醇進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)雖然各組分的最大吸收波長有所不同，但在224 nm波長檢測時各組分的檢測信號都相對較高且響應(yīng)值較為接近，見圖1，因此本實驗確定224 nm為檢測波長。

圖1 對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液（每種激素質(zhì)量濃度為10 μg/mL）色譜圖Fig.1 Chromatogram of a mixed standard solution (10 μg/mL )

2.3 萃取劑選擇

奶粉樣品中蛋白質(zhì)和脂肪是主要成分，同時也是干擾物的主要來源，因此奶粉中蛋白質(zhì)和脂肪的去除以及待測組分的提取是樣品前處理過程的關(guān)鍵。參照相關(guān)文獻(xiàn)[20-25]，萃取劑一般在乙醇、乙酸乙酯、氯仿和乙腈中選擇。通過實驗發(fā)現(xiàn)，乙醇萃取離心后溶液仍然比較混濁，過濾膜阻力特別大；乙酸乙酯萃取后溶液呈深土黃色，雜質(zhì)干擾較大；炔雌醇在氯仿中溶解度不大，氯仿提取回收率較低；乙腈提取后溶液澄清，干擾少，回收率較高，因此本實驗最終選擇乙腈作為萃取劑，同時也是蛋白質(zhì)沉淀劑。

2.4 超聲萃取與離心時間的選擇

奶粉中殘留的激素類成分直接經(jīng)乙腈萃取，回收率偏低。采用超聲萃取離心后，回收率明顯提高。本實驗分別考察了超聲萃取時間為10、20、30 min與離心5、10、15 min對萃取效率的影響，實驗數(shù)據(jù)顯示超聲萃取時間為20 min、離心時間為10 min時，萃取效率高，而且實驗時間較為相宜。故本實驗選擇此條件作為超聲萃取與離心時間。

2.5 方法的線性范圍、檢出限、定量限

將各組分一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的色譜條件下分別進(jìn)行分析。采用外標(biāo)法，根據(jù)峰面積與質(zhì)量濃度的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以3倍信噪比（RSN）計算檢出限，以10 倍信噪比（RSN）計算定量限。結(jié)果見表1。4 種激素類組分的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.992 4～0.999 7之間，檢出限在3～20 μg/kg，定量限為10～100 μg/kg。

表1 線性方程、檢出限及定量限Table 1 Regression equations, limits of detection (LOD) and limits of quantification (LOQ)

2.6 方法的回收率與精密度

表2 加標(biāo)回收率與精密度Table 2 Recoveries and precision expressed as relative standard deviations (RSD)

圖2 樣品加標(biāo)溶液（每種激素質(zhì)量濃度為2 μg/mL）色譜圖Fig.2 Chromatogram of blank sample spiked with mixed standard solution (2 μg/mL)

用空白奶粉試樣進(jìn)行添加回收率和精密度實驗。精密稱取樣品2.0 g，分別添加各激素組分低、中、高質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，搖勻，按1.3節(jié)方法操作，測定，每個添加水平平行測定3 次，計算平均加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，各組分的回收率均在80.2%～101.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.95%～2.04%之間（n=3），可見本實驗的準(zhǔn)確度與精密度良好。樣品加標(biāo)色譜圖見圖2。

2.7 樣品分析

采用本法對市售3 個品牌的孕婦奶粉、嬰幼兒1、2階段配方奶粉、中老年營養(yǎng)奶粉進(jìn)行測定，所有樣品均低于本方法檢出限，均未檢出待測的4 種激素類組分，同時在檢測過程中，未發(fā)現(xiàn)有其他明顯的干擾。樣品色譜圖見圖3。

圖3 樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of real samples

3 結(jié) 論

應(yīng)用建立的超聲波萃取-高效液相色譜法法測定奶粉中炔雌醇、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、壬基酚4 種激素類藥物殘留，各組分的加標(biāo)回收率為80.2%～101.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.95%～2.04%，實驗結(jié)果表明，該方法試劑用量少，而且無較多的干擾物產(chǎn)生，操作簡單、快速、準(zhǔn)確、成本低，應(yīng)用于奶粉中激素類成分殘留量的檢測，可以得到滿意的結(jié)果。

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