液態(tài)乳中氯丙二醇脂肪酸酯的檢測與污染水平初步調(diào)查

崔 霞，丁 顥，鄒建宏，李 珊，苗 虹,，傅武勝，趙云峰，吳永寧

（1.國家食品安全風(fēng)險評估中心 衛(wèi)生部食品安全風(fēng)險評估重點實驗室，北京 100021；2.第二炮兵總醫(yī)院，北京 100088；3.福建省疾病預(yù)防控制中心 福建省人獸共患病研究重點實驗室，福建 福州 350001）

氯丙醇脂肪酸酯（氯丙醇酯）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新型食品污染物，其在食用油和含油脂食品中的污染水平較高[1-4]。其中最典型、污染水平最高的是3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸（3-monochloropropane-1,2-diol，3-MCPD）酯[5]。3-MCPD酯在生物體內(nèi)脂肪酶的作用下分解成3-MCPD[6]。鑒于3-MCPD是氯丙醇類污染物中最重要的代表性物質(zhì)，具有生殖、腎臟和神經(jīng)毒性以及潛在的致癌作用和致突變作用[7-10]，因此，由氯丙醇脂肪酸酯引發(fā)的健康風(fēng)險也越來越受到人們的關(guān)注[8-9]。2007年，德國風(fēng)險評估機(jī)構(gòu)對氯丙醇酯的風(fēng)險評估結(jié)果引起了歐盟食品安全局和聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會的重視。歐盟食品安全局食物鏈污染物專家組評估和確認(rèn)了德國的3-MCPD酯數(shù)據(jù)，并進(jìn)一步開展3-MCPD酯健康影響的風(fēng)險評估。2008年聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會將3-MCPD酯列為優(yōu)先評價的化合物。由于2-氯-1,3-丙二醇脂肪酸（2-monochloropropane-1,3-diol，2-MCPD）的結(jié)構(gòu)與3-MCPD極其相似，其毒性以及其可能引起的健康風(fēng)險不容忽視，2-MCPD酯在食品中的污染也應(yīng)該引起關(guān)注，因此，有必要對食品中的3-MCPD酯和2-MCPD酯進(jìn)行同時測定。

目前，食品中氯丙醇酯檢測多采用氣相色譜質(zhì)譜-（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）法及液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）法，其他檢測技術(shù)幾乎未見報道。檢測的食品基質(zhì)以食用油脂最常見。LC-MS法直接測定氯丙醇酯本身，樣品前處理過程相對簡單[11-12]，因此，LC-MS法只能局限于測定某個或某些氯丙醇酯，而不能測定氯丙醇酯總量，因此不適合用于膳食暴露研究。GC-MS測定是將樣品中的與各種脂肪酸酸結(jié)合的氯丙醇酯轉(zhuǎn)化為氯丙醇進(jìn)行測定，以氯丙醇的含量表征氯丙醇酯的含量?；具^程為脂肪水解、凈化、衍生和GC-MS測定。在脂肪水解方面，現(xiàn)多采用堿水解法[13-16]，以七氟丁酰化試劑[17]和苯基硼酸（phenyl boric acid，PBA）[13,16]或丁基硼酸[14,18]為最常用的衍生化試劑。本研究在前期食用油脂檢測的基礎(chǔ)上，以液態(tài)乳為研究對象，對樣品前處理技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立了同時測定液態(tài)乳中3-MCPD酯和2-MCPD酯的檢測方法，并對30 份牛乳樣品進(jìn)行檢測，結(jié)合我國居民人均牛乳消費量對牛乳中氯丙醇酯引起的健康風(fēng)險進(jìn)行評估，以期為保障人體健康提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳樣品購自北京市的大型超市，共30 份。

3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%） 德國Aldrich公司；D5-3-MCPD（純度99%） 德國Dr Ehrenstorfer公司；2-MCPD、D5-2-MCPD、3-MCPD棕櫚酸酯和D5-3-MCPD棕櫚酸酯（純度均≥98%） 加拿大TRC公司；正己烷、乙酸乙酯（色譜純） 美國J.T.Baker公司；冰乙酸（色譜純） 美國Tedia公司；甲基叔丁基醚（分析純）天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；七氟丁酰咪唑（hepta fl uoro butyrylimidazole，HFBI）（分析純） 美國Pierce公司；甲醇鈉（分析純） 天津市福晨化學(xué)試劑廠；氯化鈉（分析純） 北京化工廠；無水硫酸鈉（優(yōu)級純，經(jīng)200 ℃烘烤8 h后使用） 天津市津科精細(xì)化工研究所；超純水，電阻率為18.2 MΩ?cm，由美國Millipore公司超純水器制備。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：精確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.01 mg）置于10 mL 棕色容量瓶中，以乙酸乙酯為溶劑定容至刻度，分別制備質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于－20 ℃冰箱保存。將標(biāo)準(zhǔn)儲備液用正己烷稀釋并定容，配制成10.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2 儀器與設(shè)備

5975C型氣相色譜儀、7890型質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、ChemElutTM硅藻土小柱（4 g，10 mL） 美國Agilent公司；Milli-Q超純水器 美國Millipore公司；G-560E渦旋混合器 美國Scientific Industries公司；NDO-400型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；N-EVAPTM 111型吹氮濃縮儀 美國Organomation Associates公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品水解與凈化

準(zhǔn)確稱取2.0 g液態(tài)乳樣品，加入10 mg/L的D5-3-MCPD棕櫚酸酯內(nèi)標(biāo)使用液60 μL（相當(dāng)于0.2 μg D5-3-MCPD），加入2 mL正己烷，并充分混勻。超聲萃取20 min，9 000 r/min 離心5min，收集正己烷相，重復(fù)提取3 次，合并提取液。加入質(zhì)量濃度為10 mg/L 的D5-2-MCPD內(nèi)標(biāo)使用液20 μL，氮吹濃縮至約500 μL。加入500 μL甲基叔丁基醚-乙酸乙酯（8∶2，V/V）和1 mL甲醇鈉-甲醇溶液（0.25 mol/L），充分振蕩，反應(yīng)4 min時加入100 μL 冰乙酸，混勻，再加入3 mL 20%的氯化鈉溶液和3 mL正己烷，渦旋振蕩1 min，棄去上層溶液。以3 mL 正己烷重復(fù)萃取一次，將下層水相溶液倒入ChemElutTM硅藻土小柱中，靜置10 min，加入15 mL乙酸乙酯洗脫，洗脫液氮吹至近干，用2 mL正己烷溶解殘渣。

1.3.2 樣品衍生

用氣密針加入HFBI 40 μL，立即密塞，渦旋混合30 s，于70 ℃恒溫箱中衍生20 min后，取出冷卻至室溫，加入20%的氯化鈉溶液2 mL，渦旋混合30 s，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相并加入0.3 g無水硫酸鈉除水分后，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾于進(jìn)樣小瓶中，供GC-MS測定。

1.3.3 氣相色譜條件

色譜柱：H P-5 M S毛細(xì)管柱（3 0 m×0.25 mm， 0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；程序升溫：50 ℃保持1 min，以2 ℃/min的速率升至90 ℃，以40 ℃/min的速率升至250 ℃，保持5 min；載氣：高純氦；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：1 μL；不分流進(jìn)樣。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子化方式為電子電離，能量70 eV；電子倍增器電壓1 000 V；選擇反應(yīng)離子監(jiān)測；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度280 ℃；四極桿溫度150 ℃；溶劑延遲時間8 min。主要質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 目標(biāo)化合物GC-MS保留時間及主要質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Main MS parameters and GC-MS retention time of target compounds

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測方法的確定

對于食品中氯丙醇酯的檢測主要包括直接測定與間接測定兩種方法。其中，直接測定法是直接測定一種或幾種不同的氯丙醇酯[19-21]，多以LC-MS法測定，作為進(jìn)行暴露風(fēng)險評估采用的方法，其缺陷為測定的是部分或大部分氯丙醇酯的含量，而不是總量，因此不能準(zhǔn)確表征食品中氯丙醇酯的真實污染狀況；間接測定法是通過酯鍵斷裂反應(yīng)使氯丙醇酯轉(zhuǎn)化為氯丙醇進(jìn)行測定，以氯丙醇的含量計氯丙醇酯的總量[2,20]，其優(yōu)點是可測定總氯丙醇酯的含量。本研究采用間接測定法，首先用正己烷將液態(tài)乳中的氯丙醇酯提取出來，以甲醇鈉進(jìn)行酯鍵斷裂反應(yīng)使氯丙醇從氯丙醇酯中游離出來，進(jìn)行衍生化后以GC-MS測定，得到氯丙醇酯的總量。

2.2 提取方法的選擇

氯丙醇酯是脂溶性物質(zhì)，在植物油樣品中可直接用甲醇鈉進(jìn)行酯鍵斷裂反應(yīng)使氯丙醇游離出來后衍生測定[14]。但液態(tài)乳樣品由于水分以及蛋白質(zhì)含量較高，基質(zhì)更為復(fù)雜，需要先將氯丙醇酯提取出來，再進(jìn)行后續(xù)處理。本研究分別采用加速溶劑萃取和以正己烷進(jìn)行的液-液萃取兩種方式進(jìn)行了提取條件的摸索，空白加標(biāo)回收實驗表明，兩種提取方法的差異不明顯。鑒于加速溶劑萃取操作復(fù)雜繁瑣，溶劑耗費量相對較大，最終確定采用以正己烷液-液萃取的方式進(jìn)行提取。

2.3 酯鍵斷裂反應(yīng)參數(shù)的確定

已有文獻(xiàn)[16-17]報道了植物油中氯丙醇酯檢測過程中酯鍵斷裂反應(yīng)條件，但液態(tài)乳樣品較植物油樣品基質(zhì)更為復(fù)雜，為避免由于樣品差異對酯鍵斷裂效果造成影響而導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差，本研究以牛乳樣品為液態(tài)乳的代表性基質(zhì)，對酯鍵斷裂反應(yīng)的參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。目前測定氯丙醇酯多采用甲醇鈉或硫酸甲醇溶液進(jìn)行酯鍵斷裂反應(yīng)[16-17]。本實驗中，使用甲醇鈉進(jìn)行酯鍵斷裂反應(yīng)，當(dāng)配制濃度為0.5 mol/L甲醇鈉的甲醇溶液時，有部分甲醇鈉析出，并懸浮于溶液中，這樣會導(dǎo)致每份樣品提取液中的甲醇鈉的量不一致，從而引起實驗結(jié)果偏差。因此本研究將甲醇鈉的濃度調(diào)整為0.25 mol/L，通過優(yōu)化確定加入量為1.0 mL，保證了測定結(jié)果穩(wěn)定可靠。

在酯鍵斷裂時間方面，德國脂肪科學(xué)（deutsche gesellschaft für fettwissenschaft，DGF）方法的水解時間為10 min[14]，有研究報道認(rèn)為應(yīng)控制在1 min左右，因酯鍵斷裂時間延長會引起氯丙醇降解[16]。本研究分別設(shè)定水解時間為0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 min，結(jié)果顯示（圖1），在4～6 min時，酯鍵斷裂效果最佳。

圖1 酯鍵斷裂時間對3-MCPD酯響應(yīng)的影響Fig.1 Effect of transesterri fication time on response of 3-MCPD esters

2.4 方法學(xué)驗證

由于在樣品前處理過程中氯丙醇酯完全水解為氯丙醇進(jìn)行后續(xù)測定，在計算氯丙醇酯的含量時分別以其對應(yīng)的氯丙醇計。因此，系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液直接用3-MCPD和2-MCPD的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制，用HFBI衍生后以GC-MS測定，記錄化合物的色譜峰面積（A）（圖2）和內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積（Ai），以A和Ai的比值對相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液中3-MCPD和2-MCPD的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸計算，得出線性方程，線性范圍和相關(guān)系數(shù)（r）。在5～500 μg/L范圍內(nèi)，3-MCPD和2-MCPD均呈良好線性相關(guān)，r大于0.999 5。

在空白樣品中添加1、2、5、10 μg/kg四個水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)樣品前處理后上機(jī)測定的響應(yīng)為基礎(chǔ)，以信噪比為3的含量作為方法的檢出限，以信噪比為10的含量作為方法的定量限。得到3-MPCD酯和2-MPCD酯檢出限均為2.0 μg/kg，定量限均為5.0 μg/kg。

本實驗選取3-MCPD棕櫚酸酯作為代表物，進(jìn)行3-MCPD酯的加標(biāo)回收實驗。由于暫未獲得商品化的2-MCPD脂肪酸酯標(biāo)準(zhǔn)品，因此采用2-MCPD代替2-MCPD脂肪酸酯進(jìn)行加標(biāo)回收實驗[17]。取空白牛乳樣品分別做10、50、100 μg/kg和200 μg/kg水平的加標(biāo)回收實驗（表2），3-MCPD酯和2-MCPD酯的回收率分別為73.5%～102.6%和89.1%～106.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.3%～6.0%和3.1%～7.7%。加標(biāo)回收實驗結(jié)果說明，方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

圖2 3-MCPD和2-MCPD衍生物及其內(nèi)標(biāo)衍生物提取離子流圖（50 μg/L）Fig.2 Extracted ion chromatograms (EIC) of derivatives of 3-MCPD,2-MCPD and internal standard (50 μg/L)

表2 牛乳樣品氯丙醇酯的加標(biāo)回收和精密度實驗結(jié)果（n=6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of fatty acid esters of chloropropanediols in spiked milk (n=6)

通過前處理條件的優(yōu)化，建立的方法準(zhǔn)確可靠、靈敏度高，可同時測定兩種在食品中污染最為廣泛的單氯丙醇酯的總量，適用于液態(tài)乳中氯丙二醇脂肪酸酯總量的檢測。與大部分報道的食品中氯丙醇酯的檢測[3,22]相比，本方法的檢測靈敏度更高，達(dá)到了2 μg/kg，這對于更準(zhǔn)確地評估氯丙醇酯對人體的膳食暴露風(fēng)險提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

2.5 牛乳中氯丙醇酯污染水平及其對人體的健康風(fēng)險評估

在北京不同區(qū)域的超市和市場采集30 份牛乳樣品，采用建立的檢測方法進(jìn)行測定。30 份牛乳樣品中3-MCPD酯的檢出率為95%，含量在未檢出（not detected，ND）～13.8 μg/kg之間，平均值為4.3 μg/kg；2-MCPD酯的檢出率為83.3%，含量在ND～10.3 μg/kg之間，平均值為3.6 μg/kg。由測定結(jié)果可見，牛乳中3-MCPD酯和2-MCPD酯的污染水平相對較低。

結(jié)合2002年中國居民營養(yǎng)與健康狀況調(diào)查中我國標(biāo)準(zhǔn)人每日牛乳的平均消費量為21.09 g，以此估算北京地區(qū)人群3-MCPD酯的膳食暴露量，得到由于攝入牛乳而導(dǎo)致的3-MCPD酯的暴露量為0.001 4 μg/（kg?d），僅為3-MCPD最大耐受攝入量（provisional maximum tolerable daily intake，PMTDI）（2 μg/（kg?d））的0.07%。2-MCPD作為3-MCPD的同分異構(gòu)體，雖目前暫無其毒性及健康指導(dǎo)值的文獻(xiàn)報道，但作為3-MCPD的同分異構(gòu)體，化學(xué)結(jié)構(gòu)與3-MCPD相似，因此本研究將2-MCPD酯的含量與3-MCDP酯含量加和后進(jìn)行了膳食暴露評估，結(jié)果顯示，北京地區(qū)人群通過牛乳消費而攝入的3-MCPD酯與2-MCPD酯的總暴露量為0.002 6 μg/（kg?d），僅占PMTDI的0.13%。用于暴露評估的牛乳的消費量為2002年調(diào)查的數(shù)據(jù)，考慮到隨著我國人民生活水平的提高，牛乳的消費量增大，若以10 倍于2012年消費量數(shù)據(jù)估算，北京地區(qū)人群對牛乳中的氯丙醇酯的膳食暴露量也只占3-MCPD的PMTDI的1.3%，健康風(fēng)險仍較低?？傮w而言，由牛乳消費攝入3-MCPD酯和2-MCPD酯所帶來的長期慢性暴露風(fēng)險較低。由于牛乳只占人們每日膳食的很小一部分，且牛乳中氯丙醇酯含量較低，北京地區(qū)人群在每日膳食中還會攝入食用油等其他可能含有污染水平較高的氯丙醇酯的食品，因此氯丙醇酯的健康風(fēng)險仍不容忽視。

3 結(jié) 論

本實驗采用堿水解和固相支持液-液萃取凈化等樣品前處理技術(shù)，建立了氣相色譜-質(zhì)譜法測定牛乳中氯丙二醇脂肪酸酯含量的方法，此方法準(zhǔn)確可靠、靈敏度高，可同時測定兩種在食品中污染最為廣泛的單氯丙醇酯的總量，適用于液態(tài)乳中氯丙二醇脂肪酸酯總量的檢測。通過對北京市售牛乳樣品進(jìn)行氯丙醇酯的測定和膳食暴露評估，初步了解到牛乳中氯丙醇酯的污染水平較低，北京地區(qū)人群通過牛乳所攝入氯丙醇酯的健康風(fēng)險較低。

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