蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）外套膜蛋白的分離提取及功能特性

梁姍姍，劉俊榮，馬永生，吳 忠，閆瑞霞，李 芳

（大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023）

貝類在中國(guó)漁業(yè)經(jīng)濟(jì)活動(dòng)中占有非常重要的地位，2007年底我國(guó)啟動(dòng)了一項(xiàng)“農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)”的科技支撐項(xiàng)目，貝類被納入其中[1]。2010年，全國(guó)海水貝類總產(chǎn)量達(dá)1 224.2萬(wàn) t，占水產(chǎn)品總產(chǎn)量的22.8%[2]，其中蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）是我國(guó)北方的主要養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類之一。扇貝外套膜占扇貝總質(zhì)量的8%左右[3]，是扇貝加工過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物。扇貝外套膜中含有大量的泥沙，極難去除，因?yàn)閭€(gè)體較小，加工比較困難，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此直接加工制成的食用產(chǎn)品價(jià)格偏高，外觀和口感都較差，一直不被消費(fèi)者所接受。只有少部分作為動(dòng)物飼料低價(jià)出售，造成資源的浪費(fèi)。

扇貝外套膜中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)的含量很高，是一種很有價(jià)值的蛋白質(zhì)源[4]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)扇貝外套膜生理活性物質(zhì)的提取研究較多，研究發(fā)現(xiàn)扇貝外套膜的提取物具有降血脂、抗病毒、抗衰老等多種生理功能[5-6]，但從食用角度出發(fā)，對(duì)其蛋白質(zhì)進(jìn)行分離提取的研究較少。本研究以扇貝外套膜為原料，通過(guò)等電點(diǎn)絮凝法提取外套膜分離蛋白，以便進(jìn)一步開(kāi)發(fā)功能性食品蛋白質(zhì)配料，進(jìn)而為扇貝外套膜高附加值的開(kāi)發(fā)應(yīng)用探索新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活的蝦夷扇貝購(gòu)自大連長(zhǎng)興水產(chǎn)品市場(chǎng)，將新鮮原料去殼，取出扇貝柱，然后將扇貝全邊中的消化腺、生殖腺除去，用清水沖洗干凈，瀝干即得蝦夷扇貝外套膜。封裝標(biāo)記后置于冰箱中-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

氫氧化鈉 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；鹽酸北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司；硫酸銅 沈陽(yáng)聯(lián)邦試劑廠；硫酸鉀 天津博迪化工股份有限公司；乙醚天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；十二烷基磺酸鈉、考馬斯亮藍(lán)R-250、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-21M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司；721型分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；MV-Ⅲ垂直平板電泳槽 大連競(jìng)邁生物科技有限公司；CR-410色彩色差儀 柯尼卡美能達(dá)投資有限公司；FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模型廠。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)的溶解與回收

冷凍蝦夷扇貝外套膜置于室溫下解凍，在半解凍狀態(tài)下切碎后稱取200 g，按1∶9（m/V）的比例加入去離子水，攪拌均勻后倒入勻漿機(jī)中勻漿2 min。漿液溫度保持在10 ℃以下。勻漿液分裝22份，每份50 mL，以0.5個(gè)pH值為梯度，一部分用2 mol/L HCl依次調(diào)節(jié)pH 1.5（酸處理），另一部分用2 mol/L NaOH依次調(diào)節(jié)pH值到12.0（堿處理）。用高速冷凍離心機(jī)4 ℃、9 000 r/min離心20 min，取中層清液，用2 mol/L HCl或2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)蝦夷扇貝外套膜溶出物至等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)，4 ℃、9 000 r/min離心20 min，得到分離蛋白和未回收溶出物。

1.3.2 理化指標(biāo)測(cè)定

水分測(cè)定采用GB/T5009.3—2003《食品中水分的測(cè)定》直接干燥法；粗脂肪測(cè)定采用GB/T5009.6—2003《食品中脂肪的測(cè)定》索氏抽提法；粗蛋白的測(cè)定采用GB/T5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》微量凱氏定氮法；灰分的測(cè)定采用GB/T5009.4—2003《食品中灰分的測(cè)定》灼燒稱質(zhì)量法。

1.3.3 蛋白質(zhì)溶解度和回收率的測(cè)定

采用雙縮脲法測(cè)定總蛋白及上層清液中蛋白質(zhì)的含量[7]，用721型分光光度計(jì)在波長(zhǎng)540 nm測(cè)定其吸光度。蛋白質(zhì)溶解度與回收率的計(jì)算公式參見(jiàn)傅潤(rùn)澤等[8]的方法。

以0.5個(gè)pH值為梯度測(cè)定扇貝蛋白在pH值1.5～12.0范圍的蛋白質(zhì)溶解度和回收率，計(jì)算公式如式（1）、（2）所示。

式中：m1為第1次離心中層清液蛋白質(zhì)質(zhì)量/g；m2為第2次離心上清液蛋白質(zhì)質(zhì)量/g；m3為總蛋白質(zhì)質(zhì)量/g。

1.3.4 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分析

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）對(duì)酸堿提取過(guò)程中各部分的蛋白質(zhì)組成進(jìn)行分析。選取pH 1.5、12.0兩個(gè)pH值點(diǎn)。分析的樣品包括勻漿液、分離蛋白、未溶解沉淀物及未回收溶出物。樣品與4×SDS樣品緩沖液以3∶1的體積比混合，加入5%的β-巰基乙醇，在95 ℃條件下水浴10 min，在5%濃縮膠、12%分離膠下進(jìn)行電泳。電泳膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色，脫色液脫色。

1.3.5 蛋白質(zhì)功能特性

蛋白質(zhì)的持水性測(cè)定方法為[9]，稱取0.5 g樣品（m）置于已知質(zhì)量的離心管（m1）中，加入20 mL蒸餾水。在室溫下攪拌，使蛋白質(zhì)溶液成漿狀；靜置30 min后，在3 000 r/min離心20 min；棄去上清液，再次稱量離心管（m2），按照公式（3）計(jì)算持水性。

蛋白質(zhì)持油性的測(cè)定方法為[10]：稱取0.5 g樣品（m）置于已知質(zhì)量（m1）的離心管中，加入10 mL大豆油，攪拌混合物使其均勻，靜置30 min后，在3 000 r/min下離心20 min，棄去上清液，再次稱離心管質(zhì)量（m2），按照公式（4）計(jì)算持油性。

蛋白質(zhì)的起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定方法為[11]：將測(cè)試蛋白配制成5 g/100 mL的水懸液，取30 mL放入100 mL離心管中，用高速均質(zhì)機(jī)均質(zhì)2 min，立即記錄此時(shí)溶液上部泡沫體積，靜置30 min后，再次記錄其泡沫體積。按照公式（5）、（6）計(jì)算起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

乳化性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定采用濁度法[12]。配制1 g/100 mL的蛋白液，取5 mL大豆油與15 mL待測(cè)溶液于均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)2 min，分別于0、10 min時(shí)從底部取50 μL，用0.1%SDS稀釋100 倍后測(cè)OD500nm。按照公式（7）、（8）計(jì)算乳化性和乳化穩(wěn)定性。

式中：n為稀釋倍數(shù)；A為500 nm波長(zhǎng)處的吸光度；φ為油相所占的分?jǐn)?shù)，本實(shí)驗(yàn)中油相占1/4；ρ為0.01，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度/（g/mL）。

式中：A0為0 min時(shí)的乳化液500 nm波長(zhǎng)處的吸光度；t為靜置時(shí)間（10 min）；A10為乳化液靜置10 min后的吸光度。

1.3.6 色度分析

使用CR-410色彩色差儀來(lái)確定分離蛋白及原料的顏色特性，每個(gè)樣品測(cè)量3次，得到L*、a*和b*值，其中L*值表示產(chǎn)品的亮度即從黑（0）到白（100）的顏色，a*值表示紅度（＋）或綠度（-）值，正值越大偏向紅色的程度越大，負(fù)值越大偏向綠色的程度越大；b*值表示黃度（＋）或藍(lán)度（-）值，正值越大偏向黃色的程度越大，負(fù)值越大偏向藍(lán)色的程度越大；白度則根據(jù)式（9）計(jì)算[13]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦夷扇貝外套膜蛋白溶解度的變化規(guī)律

蛋白質(zhì)的溶出不僅是等電點(diǎn)絮凝回收的前提，而且，在溶出過(guò)程中還可以使色素、脂肪、灰分以及結(jié)締組織等成分與蛋白質(zhì)分離[14-15]。在pH 1.5～12.0范圍內(nèi)，蝦夷扇貝外套膜蛋白質(zhì)的溶解規(guī)律如圖1所示。

圖1 扇貝外套膜蛋白質(zhì)在不同pH值的溶解度變化曲線Fig.1 Solubility of Patinopecten yessoensis mantle proteins as a function of pH

由圖1可知，在酸性及堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)最大溶解度均出現(xiàn)在極端pH值條件下，分別為pH 1.5和pH 12.0，在酸性的pH 4.0以下和堿性的pH 9.0以上時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度均急劇增加，這要?dú)w因于肌肉蛋白質(zhì)分子所帶的凈正電荷或凈負(fù)電荷增加。帶同種電荷的蛋白質(zhì)分子之間相互排斥，從而保證蛋白質(zhì)分子處于分離狀態(tài)；同 時(shí)帶電的蛋白質(zhì)分子與水分子之間形成離子-偶極作用而被溶劑化[16]。在pH 4.0～9.0內(nèi)，蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷不足，與水分子間的作用較弱，蛋白質(zhì)分子之間趨于相互作用，所表現(xiàn)出的溶解度也不高，這與Undeland[17]、Gehring[18]等的研究結(jié)果相似。在pH 4.5～5.0時(shí)溶解度最低，此為扇貝外套膜蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。與之相比，通常魚肉蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為pH 5.5，這可能是由于扇貝外套膜與魚肉蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)的組成與結(jié)構(gòu)方面存在一定的差異性。

2.2 蝦夷扇貝外套膜蛋白質(zhì)回收率的變化規(guī)律

圖2 蝦夷扇貝外套膜蛋白質(zhì)在不同pH值的回收率變化曲線Fig.2 Recovery rate of Patinopect en yessoensis mantle proteins as a function of pH

圖3 蝦夷扇貝外套膜蛋白質(zhì)溶解度與回收率的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis between Patinopecten yessoensis mantle protein solubility and recovery rate

由圖2可知，回收率變化規(guī)律與溶解度變化規(guī)律基本一致。由圖3可知，二者具有十分顯著的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 7。無(wú)論是酸處理還是堿處理，蛋白質(zhì)的最大回收率均發(fā)生在其溶解度最高的pH值點(diǎn)，分別為83.31%及90.75%。與魚類分離蛋白回收率（60%～80%）相比[8]，蝦夷扇貝外套膜蛋白質(zhì)回收率相對(duì)較高。

2.3 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白分子質(zhì)量分析

利用SDS-PAGE法對(duì)蝦夷扇貝外套膜分離蛋白及其制備過(guò)程中未回收部分 中各組分蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖4、5。

圖4 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE of the protein isolates extracted from Patinopecten yessoensis mantle

圖5 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白制備過(guò)程中未回收部分的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.5 SDS-PAGE of unrecovered protein fractions during Patinopecten yes soensis mantle protein isolation

由圖4可知，蝦夷扇貝外套膜主要蛋白質(zhì)組分有肌球蛋白、副肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白以及原肌球蛋白等，而酸分離蛋白和 堿分離蛋白的條帶與原料很相似。扇貝是無(wú)脊椎動(dòng)物，其蛋白質(zhì)的組成及結(jié)構(gòu)與脊椎動(dòng)物存在一定的 差異性，分布在100 kD附近的蛋白質(zhì)條帶是副肌球蛋白，它是無(wú)脊椎動(dòng)物特有的肌原纖維蛋白質(zhì)[19]。由圖5可知，酸溶和堿溶過(guò)程有少量蛋白質(zhì)未被溶出，堿處理未溶出沉淀中的蛋白條帶較酸處理的多，泳道3和4中酸處理和堿處理未回收溶出物的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量都在40 kD左右。對(duì)比圖4、5可知，等電點(diǎn)絮凝法能夠有效回收大部分的蛋白質(zhì)溶出物組分，使得未回收溶出物的蛋白含量很低，造成條帶的不清晰或無(wú)條帶。

2.4 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白基本成分分析

表1 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白的基本成分（ ±s，n=3）Table 1 Proximate composition ofPatinopecten yessoensis mantle protein isolateess ( ±s, n=3)

表1 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白的基本成分（ ±s，n=3）Table 1 Proximate composition ofPatinopecten yessoensis mantle protein isolateess ( ±s, n=3)

注：同列字母不同，表示差異顯著（P＜0.05）。下同。

產(chǎn)物 蛋白質(zhì)含量/% 脂肪含量/% 灰分含量/%扇貝外套膜 77.78±0.79a 3.55±0.24a 3.17±0.06a酸分離蛋白 80.21±0.33b 1.02±0.06b 2.67±0.05b堿分離蛋白 84.28±0.95c 0.80±0.02b 1.81±0.18c

由表1可知，與原料扇貝外套膜相比，酸、堿分離蛋白均有較高的蛋白質(zhì)純度，分別為酸分離蛋白的80.21%及堿分離蛋白的84.28%。酸法回收蛋白與堿法回收蛋白脂肪含量得到明顯降低，從原料的3.55%分別下降到1.02%及0.80%，脂肪含量較低，更利于貯存，這說(shuō)明分離處理能夠有效去除原料中的脂肪。

2.5 蝦夷扇貝外套膜及其分離蛋白的色度分析

產(chǎn)品的色澤外觀是影響產(chǎn)品感官特性的第一因素，表2比較了酸法分離蛋白、堿法分離蛋白與原料扇貝外套膜的顏色差別。與原料相比，酸分離蛋白和堿分離蛋白均表現(xiàn)出較高的白度，其中酸分離蛋白的白度更高，對(duì)于魚類肌肉，通常其堿分離蛋白的白度要高于酸分離蛋白[20]，這可能是由于堿法能夠去除更多的血紅蛋白。堿法處理后，在等電點(diǎn)范圍內(nèi)有大量的血紅蛋白處于溶解狀態(tài)，未被沉淀出來(lái)，從而與其他蛋白分離，而酸法處理則恰恰相反[13]，但也有相反的研究報(bào)道[21]。酸分離蛋白和堿分離蛋白的亮度L*均有顯著提升，a*和b*都為正值，且都有下降，a*值反映的是紅值，b*值反映的是黃值，紅值和黃值均減小說(shuō)明兩種方法都能有效地去除部分的天然色素類物質(zhì)，兩種蛋白的白度均大于原料，說(shuō)明兩種蛋白的感官接受度較原料均有提高。

表2 蝦夷扇貝外套膜及其分離蛋白的色度值（ ±s，n=3）Table 2 Color values of Patinopecten yessoensis mantle and proteiinn isolates (±s, n =3)

表2 蝦夷扇貝外套膜及其分離蛋白的色度值（ ±s，n=3）Table 2 Color values of Patinopecten yessoensis mantle and proteiinn isolates (±s, n =3)

指標(biāo) 扇貝外套膜 酸分離蛋白 堿分離蛋白L* 60.65±0.09a 68.55±0.16c 67.20±0.31b a* 4.97±0.20a 3.48±0.07c 2.78±0.06b b* 12.55±0.14a 11.02±0.28b 12.17±0.22a白度 58.40±0.04a 66.49±0.22b 6 4.91±0.26c

2.6 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白功能特性

表3 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白的功能性質(zhì)Table 3 Functional properties of Patinopecten yessoensis mantle protein isolates

由表3可知，與大豆蛋白相比，酸法與堿法分離蛋白除了持油性稍高，其他包括持水性、發(fā)泡性和乳化性都較差，因此需要進(jìn)一步研究來(lái)提高蝦夷扇貝外套膜分離蛋白的功能性，從而增強(qiáng)其在食品中的應(yīng)用性。

3 結(jié) 論

等電點(diǎn)絮凝法能有效地對(duì)蝦夷扇貝外套膜蛋白質(zhì)進(jìn)行分離回收。研究發(fā)現(xiàn)蝦夷扇貝外套膜蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在pH 4.5～5.0范圍內(nèi)；分離產(chǎn)物不僅蛋白質(zhì)純度高，且有明顯的脫脂及脫色效果?？傊?，等電點(diǎn)絮凝法對(duì)于開(kāi)發(fā)利用蝦夷扇貝外套膜蛋白質(zhì)極具潛力。今后，就分離蛋白的功能性開(kāi)發(fā)方面，有待進(jìn)一步研究。

[1]劉俊榮, 章超樺, 蔣海山, 等.歐盟食品安全管理體系給中國(guó)貝類產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的啟示[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2010(5): 442-449.

[2]農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局.2011中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒[M].北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2011.

[3]辛草, 劉俊榮, 蔡秋鳳, 等.三種經(jīng)濟(jì)扇貝的基本工藝性質(zhì)及蛋白質(zhì)分析[J].水產(chǎn)科學(xué), 2012, 31(9): 535-539.

[4]蘇秀榕, 李太武, 丁明進(jìn).扇貝營(yíng)養(yǎng)成分的研究[J].海洋科學(xué),199 7(2): 10-11.

[5]黃翠麗, 劉賽.扇貝的生理活性物質(zhì)和藥用價(jià)值[J].中國(guó)海洋藥物,2001, 20(2): 45-47.

[6]于囡, 劉賽, 王海桃, 等.扇貝裙邊糖胺聚糖體外抗I型單純皰疹病毒實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2008(2): 210-213.

[7]PALAFOX H, C RDOVA-MURUETA J H, NAVARRET E del TORO M A, et al.Protein isolates from jumbo squid (Dosidicus gigas) by pH-shift processing[J].Pro cess Biochemistry,2009, 44(5): 584-587.

[8]傅潤(rùn)澤, 劉俊榮, 王帥, 等.采用酸堿提取法對(duì)鰱肌肉蛋白分離 特性的影響[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2011(6): 539-543.

[9]盛彩虹, 劉曄, 劉大川, 等.紫蘇分離蛋白功能性研究[J].食品科學(xué),2011, 32(17): 137-140.

[10]FREITAS I R, GAUTERIO G V, RIOS D G, et al.Functionality of protein isolates fromArgen tine anchovy(Engraulis anchoita) residue obtained using pH shift processing[J].Journal of Food Science and Engineering,2011, 5(1): 374-378.

[11]VIOQUE J, S NCHEZ-VIOQUE R, CLEMENTE A, et al.Partially hydrolyzed rapeseed protein isolates with improved functional properties[J].Journal of the Ameri can Oil Chemists’ Society,2000,77(4): 447-450.

[12]PEARCE K N, KINSELLA J E.Emulsifyin g properties of proteins:evaluation of a turbidimetric technique[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1978, 26(3): 716-723.

[13]KRISTINSSON H G, THEODORE A E, DEMIR N, et al.A comparative study between acid- and alkali-aid ed processing and surimi processing for the recovery of proteins from channel catfish muscle[J].Journal of Food Science,2005, 70(4): 298-306.

[14]NOLSOE H, UNDELAND I.The acid and alkaline solubilization pr ocess for the isolation of muscle proteins: state of the art[J].Food and Bioprocess Technology,2009, 2(1): 1-27.

[15]KRISTINSSON H G, LIANG Y.Effect of pH-shift processing a nd surimi processing on Atlantic croaker (Micropogonias undulates)muscle proteins[J].Journal of Food Science,2006, 71(5): 304-312.

[16]FENNEMA O R.Food Chemistry[M].3th ed.New York: Marcel Dekker, Inc, 1996.

[17]UNDELAND I, KELLEHER S D, HULTIN H O, et al.Consistency and solubility changes in herring (Clupea harengus) light muscle homogenates as a function of pH[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,200 3, 51(14): 3992-3998.

[18]GEHRING C K, DAVENPORT M P, JACZYNSKI J.Functional and nutritional quality of protein and lipid recovered from fish processing by-products and underutilized aquatic spe cies using isoelectric solubilization/precipitation[J].Current Nutrition & Food Science,2009, 5(1): 17-39.

[19]鴻巢章二.水產(chǎn)利用化學(xué)[M].北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1994.

[20]UNDELAND I, KELLEHER S D, HULTIN H O.Recovery of functional proteins from herring (Clupea harengus) light muscle by an acid or alkaline solubilization proces s[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2002, 50(25): 7371-7379.

[21]MARMON S K, UNDELAND I.Protein Isolation from gutted herring(Clupea harengus) using pH-shift processes[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2010, 58(19):10480-10486.