滁菊總黃酮的鎮(zhèn)痛作用及與一氧化氮和前列腺素E2的關(guān)系

張蓓蓓，陳志武，羅勝勇，馬 征

◇藥學(xué)研究◇

滁菊總黃酮的鎮(zhèn)痛作用及與一氧化氮和前列腺素E2的關(guān)系

張蓓蓓1，2，陳志武1，羅勝勇3，馬 征3

目的研究滁菊總黃酮（TFCC）的鎮(zhèn)痛作用及其可能機(jī)制。方法鎮(zhèn)痛作用采用小鼠扭體法、溫浴法、福爾馬林法、熱板法進(jìn)行檢測；血清和腦組織中一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）含量分別采用Griess法和紫外分光光度法測定。結(jié)果灌胃給藥TFCC 100、200 mg/kg可明顯減少小鼠扭體反應(yīng)數(shù)，降低小鼠福爾馬林致痛作用第Ⅱ時(shí)相疼痛反應(yīng)評分值，延長小鼠熱板舔足反應(yīng)潛伏期和熱水縮尾反應(yīng)潛伏期；小鼠側(cè)腦室給藥TFCC 5、10 mg/kg可明顯抑制小鼠扭體反應(yīng)。灌胃給藥TFCC 100、200 mg/kg可明顯提高小鼠血清和腦組織中NO含量，但可降低PGE2含量。結(jié)論TFCC具有明顯鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛機(jī)制可能與促進(jìn)NO釋放和抑制PGE2生成有關(guān)。

滁菊總黃酮；鎮(zhèn)痛；一氧化氮；前列腺素E2

滁菊為菊科多年生草本植物，產(chǎn)于安徽滁州，是菊花中花瓣最為緊密的一種，其藥用價(jià)值名列全國四大藥菊之首。滁菊性微寒、味辛、苦、甘，歸肝肺經(jīng)，具有疏風(fēng)、清熱、明目、解毒之功效［1］，主要治療頭痛、眩暈、目赤、心胸?zé)?、疔瘡、腫毒等癥。滁菊藥用部分為其干燥頭狀花序，主要成分有黃酮類、揮發(fā)油類、氨基酸類和微量元素類等。文獻(xiàn)［2］報(bào)道黃酮類化合物如金絲桃苷、槲皮素、蘆丁等，有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用。筆者推測滁菊總黃酮（total flavone of Chuzhou chrysanthemum，TFCC）可能也有一定的鎮(zhèn)痛作用，因此，該研究采用多種鎮(zhèn)痛模型對TFCC的鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物昆明種小鼠，SPF級，18～22 g，雌雄各半（熱板法用雌性小鼠），由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物分組分籠飼養(yǎng)于12 h明暗交替的環(huán)境中，溫度為18～21℃，相對濕度為（50± 5）%，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由攝食、飲水。

1.2 藥品TFCC：由安徽醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院植物化學(xué)研究所從滁菊中提取，黃色粉末，總黃酮含量＞60%，使用前用生理鹽水（NS）配制；嗎啡（morphine，Mor）：沈陽第一制藥廠，批號006283；阿司匹林（aspirin，Asp）：中國醫(yī)藥公司上海分公司，批號960120；一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號20120809。其他所用試劑均為國產(chǎn)AR級試劑。

1.3 方法

1.3.1 小鼠扭體法［3］昆明種小鼠隨機(jī)分為6組：生理鹽水組（NS）、陽性對照藥Mor組（4 mg/kg）、Asp組（40 mg/kg）、TFCC（50、100和200 mg/kg）組，每組10只，雌雄各半。除Mor為腹腔內(nèi)注射一次給藥外，其他各組小鼠分別灌胃NS或受試藥1次/d，連續(xù)5 d。Mor給藥30 min時(shí)；其他受試藥或NS末次給藥60 min時(shí)，每只小鼠腹腔內(nèi)注射0.6%冰醋酸0.2 ml，觀察記錄15 min內(nèi)小鼠扭體總數(shù)。

1.3.2 小鼠溫浴法［3］將小鼠放入特制鼠籠裝置的固定筒內(nèi)，尾尖浸入50℃恒溫水浴中，侵入長度為3 cm，觀察記錄尾回縮出水面的潛伏期（tail-curling latencies，TCL），以TCL作為痛閾。預(yù)先篩選痛閾5～30 s者為合格鼠，給藥前測痛2次，間隔5 min，取其平均值作為基礎(chǔ)痛閾。小鼠分組及給藥情況同1.3.1。

1.3.3 小鼠福爾馬林法［3］小鼠右后足跖皮下注射2 mol/L福爾馬林20 μl后，立即置于20 cm玻璃缸中，觀察注射后0～10 min（第Ⅰ時(shí)相）和10～60 min（第Ⅱ時(shí)相）動物的行為反應(yīng)。并對小鼠的痛反應(yīng)進(jìn)行疼痛分級（每次觀察時(shí)間為3 min）：舔、咬或抖足3分；提足2分；輕觸底面但不負(fù)重，行走時(shí)跛行1分；正常負(fù)重，走動自如0分。小鼠分組及給藥情況同1.3.1。

1.3.4 小鼠熱板法［4］將小鼠置智能恒溫?zé)岚鍍x上（55.0±0.5）℃，以小鼠出現(xiàn)舔后足反應(yīng)潛伏期為痛閾指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)前篩選痛閾5～30 s者為合格鼠，給藥前測痛2次，間隔10 min，取其平均值作為基礎(chǔ)痛閾。除各組均為雌性小鼠外，分組及給藥情況同1.3.1，于末次給藥后15、30、60、90 min各重復(fù)測定舔足潛伏期。

1.3.5 小鼠側(cè)腦室法［5］小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組（NS）、Mor對照組（0.2 mg/kg）、Asp對照組（2.0 mg/kg）及TFCC（5、10 mg/kg）組，每組10只，雌雄各半。在小鼠頭部兩耳線與矢狀縫交點(diǎn)的左右前外各2 mm處進(jìn)針，深度為2 mm，注射受試藥10 μl。給藥15 min后，按1.3.1方法測定小鼠扭體反應(yīng)情況。

1.3.6 生化指標(biāo)的測定［6］雌性小鼠隨機(jī)分為5組，分別腹腔內(nèi)注射NS、Mor 4.0 mg/kg及TFCC 50、100、200 mg/kg。60 min后置于（55.0±0.5）℃熱板儀上測痛2次，然后摘取小鼠眼球取血，以3 500 r/min離心15 min制備血清，并快速取腦，稱重后勻漿。將血清和腦勻漿液置－20℃冰箱保存待測生化指標(biāo)。NO含量以Grieen法測定，按試劑盒提供方法操作后在550 nm處測定其吸收度；前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）含量用紫外分光光度法測定，將PGE2在堿性液中脫水、異構(gòu)化變?yōu)镻GB1，在278 nm處測定其吸收度（A值）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，兩組數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 TFCC對小鼠扭體反應(yīng)的影響與NS組比較，4 mg/kg Mor組可完全抑致小鼠扭體反應(yīng)（P＜0.01）；與NS組比較，40 mg/kg Asp組，TFCC 100、200 mg/kg可明顯減少小鼠扭體反應(yīng)數(shù)（P＜0.01）。見表1。

表1 TFCC對小鼠扭體反應(yīng)的影響（n＝10，±s）

表1 TFCC對小鼠扭體反應(yīng)的影響（n＝10，±s）

與NS組比較：**P＜0.01

組別劑量（mg/kg）扭體數(shù)（次/15 min）抑制率（%）NS－25.2±4.2－Mor40**100.0 Asp4016.5±3.7**34.5 TFCC5022.8±4.69.5 10017.1±3.6**32.1 20013.8±5.5**45.2

2.2 TFCC對小鼠溫浴法致小鼠縮尾反應(yīng)的影響

與NS組比較，4 mg/kg Mor組、40 mg/kg Asp組、TFCC（100、200 mg/kg）組小鼠縮尾潛伏期明顯延長（P＜0.01）。見表2。

表2 TFCC對小鼠溫浴法致小鼠縮尾反應(yīng)的影響（n＝10，±s）

表2 TFCC對小鼠溫浴法致小鼠縮尾反應(yīng)的影響（n＝10，±s）

與NS組比較：**P＜0.01

組別劑量（mg/kg）縮尾潛伏期（s）給藥前給藥后1 h NS－11.6±3.912.0±3.2 Mor412.6±3.050.4±8.4**Asp4012.9±3.420.4±5.4**TFCC5012.5±1.812.3±3.1 10012.7±3.016.0±3.2**20011.9±3.128.1±2.5**

2.3 TFCC對福爾馬林誘發(fā)小鼠疼痛反應(yīng)的影響

與NS組比較，腹腔內(nèi)注射4 mg/kg Mor對福爾馬林致小鼠疼痛Ⅰ相和Ⅱ相反應(yīng)均有明顯抑制作用（P＜0.01）；與NS組比較，40 mg/kg Asp組、TFCC（100、200 mg/kg）組對第Ⅰ時(shí)相（即5 min時(shí)）的疼痛反應(yīng)無明顯影響，但可顯著降低第Ⅱ時(shí)相（即15 min時(shí)）的疼痛反應(yīng)評分值（P＜0.01）。見表3。

表3 TFCC對福爾馬林誘發(fā)小鼠疼痛反應(yīng)的影響（n＝10，±s）

表3 TFCC對福爾馬林誘發(fā)小鼠疼痛反應(yīng)的影響（n＝10，±s）

與NS組比較：**P＜0.01

?

2.4 TFCC對小鼠熱板致痛反應(yīng)的影響與NS組比較，4 mg/kg Mor可明顯抑制小鼠熱板反應(yīng)，100、200 mg/kg TFCC灌胃給藥可延長小鼠熱板反應(yīng)舔足潛伏期（P＜0.01，P＜0.05）。見圖1。

2.5 側(cè)腦室注射TFCC對小鼠扭體反應(yīng)的影響側(cè)腦室注射Mor 0.2 mg/kg可完全抑制腹腔內(nèi)注射0.6%冰醋酸誘發(fā)的小鼠扭體反應(yīng)，側(cè)腦室注射5、10 mg/kg TFCC也可明顯減少小鼠扭體反應(yīng)數(shù)，但側(cè)腦室注射Asp 2.0 mg/kg對小鼠扭體反應(yīng)無明顯影響。見表4。

2.6 TFCC對小鼠腦組織和血清NO、PGE2含量的影響與NS組比較，TFCC 200 mg/kg顯著增加小鼠腦組織和血清中NO含量（P＜0.01），TFCC 100 mg/kg也可顯著增高小鼠腦組織中NO含量（P＜0.05），見圖2；與NS組比較，TFCC 100和200 mg/kg還可顯著降低小鼠腦組織和血清中PGE2含量（P＜0.01），見圖3。

圖1 TFCC對小鼠熱板致痛反應(yīng)的影響（n＝10，±s）

圖2 TFCC對小鼠腦組織和血清中NO含量的影響（n＝10，±s）

圖3 TFCC對小鼠腦組織和血清中PGE2含量的影響（n＝10，±s）

表4 側(cè)腦室注射TFCC對冰醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響（n＝10，±s）

表4 側(cè)腦室注射TFCC對冰醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響（n＝10，±s）

與NS組比較：**P＜0.01

組別劑量（mg/kg）扭體數(shù)（次/15 min）抑制率（%）NS－24.8±6.3－Mor0.20**100.0 Asp2.020.2±3.318.5 TFCC516.6±3.5**33.1 1011.9±4.0**52.0

3 討論

生物總黃酮是許多中草藥的有效成分，具有降血糖、抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗過敏、抗癌等多種重要的生物活性。研究［2，5］表明銀杏、映山紅中的總黃酮可以抑制由化學(xué)或熱刺激誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)動物疼痛反應(yīng)。

扭體法實(shí)驗(yàn)是模擬腹腔炎癥的一種慢性持續(xù)性病理性內(nèi)臟痛實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停ㄟ^注射冰醋酸導(dǎo)致小鼠感染腹膜炎而產(chǎn)生疼痛表現(xiàn)［7－8］。小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)中，總黃酮能顯著減少小鼠扭體次數(shù)且對于延遲扭體反應(yīng)開始時(shí)間也有明顯作用［9］。在本實(shí)驗(yàn)中，注射TFCC 100、200 mg/kg能顯著抑制小鼠由內(nèi)臟疼痛導(dǎo)致的扭體次數(shù)。溫浴法實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明TFCC對小鼠疼痛反應(yīng)有一定抑制作用，給藥后TFCC 200 mg/kg組痛閾潛伏期長于NS組。福爾馬林法致痛模型模擬的是急性組織損傷所致的持續(xù)性疼痛，此模型引起的疼痛與臨床慢性疼痛具有較好的相似性，其特點(diǎn)是引起的疼痛分為兩個(gè)時(shí)相，分別代表不同類型的疼痛［10］。小鼠右后足跖皮下注射福爾馬林0～10 min為第Ⅰ相反應(yīng)（早期相），10～60 min為第Ⅱ相反應(yīng)（遲發(fā)相），Ⅰ相反應(yīng)主要為直接刺激C纖維所致，Ⅱ相反應(yīng)有炎癥機(jī)制參與［3］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TFCC可明顯抑制小鼠Ⅱ相反應(yīng)，表明TFCC對炎癥介質(zhì)所參與的疼痛反應(yīng)有明顯鎮(zhèn)痛作用。

側(cè)腦室注射藥法是一種可用于確定藥物是否具有中樞鎮(zhèn)痛作用的常用方法，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，側(cè)腦室注射TFCC為灌胃給藥劑量的1/20（即5 mg/kg）時(shí)便可顯著減少小鼠扭體反應(yīng)數(shù)，提示TFCC對小鼠可能有中樞性鎮(zhèn)痛作用。熱板法是一種經(jīng)典快痛實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，是篩選中樞鎮(zhèn)痛藥的有效方法［3］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Asp在該模型沒有明顯的鎮(zhèn)痛作用，但與Mor一樣，TFCC可延長小鼠舔足潛伏期，提示TFCC在該模型上有鎮(zhèn)痛作用，這與上述側(cè)腦室注射給藥也是一致的，即TFCC可能有中樞性鎮(zhèn)痛作用。

NO是一種重要的信息傳遞物質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)。近年來有關(guān)NO對疼痛的影響研究很多，爭議也較多，已知NO在外周和中樞中以不同水平參與痛覺的調(diào)節(jié)。有研究［6］表明，腦組織中NO含量增高，可以提高機(jī)體的疼痛閾值，具有鎮(zhèn)痛作用。本研究表明TFCC在抑制小鼠熱板反應(yīng)時(shí)能提高腦組織及血清中NO含量，提示TFCC鎮(zhèn)痛作用可能與促進(jìn)NO釋放有關(guān)。PGE2是一種非常重要的疼痛介質(zhì)之一，PGE2的外周致痛作用早已明確［10－11］。本研究表明，TFCC可降低腦組織和血清中的PGE2含量，提示TFCC的鎮(zhèn)痛作用與抑制PGE2合成也有一定關(guān)系。

綜上所述，TFCC具有明顯鎮(zhèn)痛作用，是一種具有很好開發(fā)前景的鎮(zhèn)痛藥物，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)腦組織和血清中NO釋放，降低腦組織和血清中PGE2含量有關(guān)。

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The relationship between analgesic effect of total flavonoids of Chuzhou chrysanthemum and nitric oxide and prostaglandin E2

Zhang Beibei1，2，Chen Zhiwu1，Luo Shengyong3，et al
（1Dept of Pharmacology，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Biochemistry，Chuzhou City Vocation College，Chuzhou 239000；3Institute of Pharmacology Toxicology，Anhui Academy of Medical Sciences，Hefei 230061）

ObjectiveTo study the analgesic effect of total flavone of Chuzhou chrysanthemum（TFCC）and its mechanism.MethodsWrithing test，warm bath method，formalin method，the hot plate test were used to examine analgesic effect on mice，and serum and brain tissue nitric oxide（NO）and prostaglandin E2（PGE2）contents were determinated the Griess method and ultraviolet spectrophotometry.ResultsIntragastrical administration of TFCC 100 mg/kg and 200 mg/kg could significantly reduce the writhing number in mice，II-phase pain in formaldehyde induced pain in mice，and prolonged the mice hot plate licking foot response latency and hot shrinkage tail reaction time.Intracerebroventricular injection TFCC 5 mg/kg and 10 mg/kg could significantly inhibit the writhing number in mice.TFCC 100 mg/kg and 200 mg/kg significantly increased mice serum and brain NO contents，and reduced PGE2contents.ConclusionTFCC has obvious analgesic effect，and its analgesic mechanism may be related to the promation of NO release and the inhibition of PGE2.

total flavonoids of Chuzhou chrysanthemum；analgesic；nitric oxide；prostaglandin E2

R 282.71；R 971.1

A

1000－1492（2014）03－0323－04

2013－09－17接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81173596）

1安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，合肥 230032

2滁州城市職業(yè)學(xué)院生物化學(xué)教研室，滁州 239000

3安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥理毒理研究所，合肥 230061

張蓓蓓，女，講師，碩士研究生；陳志武，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：chpharmzw＠163.com