兩種松科植物松多酚體外抗氧化活性評價

劉 冉，王振宇，盧 靜，歐陽樂

（1.東北林業(yè)大學(xué)森林植物資源學(xué)科，黑龍江哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)科，黑龍江哈爾濱150040；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090）

松多酚是一類天然多酚類物質(zhì)，是一類最普遍的植物次生代謝產(chǎn)物，在植物正常生長抵御感染和損傷方面都是十分重要的[1-2]，隨飲食攝入后，經(jīng)機體吸收增加了血液抗氧化能力，有助于預(yù)防癌癥和心腦血管疾病大的發(fā)生[3-4]，在營養(yǎng)、健康、醫(yī)藥領(lǐng)域的關(guān)注度逐漸增高[5]。機體中的氧化反應(yīng)和自由基導(dǎo)致了細胞損傷、炎癥、腫瘤和心血管疾病的發(fā)生，植物多酚作為一種天然抗氧劑能夠抑制或者中斷氧化進程和平衡機體自由基，從而可以達到預(yù)防這些疾病的效果[1，5]。松樹皮提取物對于多方面的疾病有一定的治療作用，特別是對于心腦血管疾病是非常有益的，如舒緩血管和通過調(diào)節(jié)毛細管滲透率改善微循環(huán)[6]。碧螺芷PYC是Pinus pinaster的樹皮提取物，現(xiàn)在已經(jīng)作為一種食品營養(yǎng)補充劑遍及全球，其主要成分有低聚原花青素（65%～75%）、酚酸和花旗松素[7]。通過對一些松科植物[8-10]松樹皮提取物研究發(fā)現(xiàn)，原花青素是最主要的成分，是由兒茶素和表兒茶素單體通過C4→C8和（或）C4→C6鍵合連接在一起的低聚體或高聚體[2]。近些年，原花青素受到特別關(guān)注，主要是因為他們的藥理活性，特別是在抗動脈粥樣硬化和清除自由基方面[11]。紅松（Pinus koraiensis）、紅皮云杉（Picea koraiensis）為松科常綠喬木[12]，是我國重要的珍貴用材樹種[13]，目前針對紅松和紅皮云杉松多酚研究的報道較少。本文以紅松和紅皮云杉兩種松科植物為實驗原料，研究樹皮松多酚的體外抗氧化活性，進一步對松多酚的成分進行分析對比，為以后松多酚的深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅松樹皮、紅皮云杉樹皮 小興安嶺地區(qū)；沒食子酸、DPPH、D-脫氧核糖 美國Sigma公司，分析純；蘆丁、原花青素 上海源葉生物科技有限公司，色譜純；福林酚試劑、硫代巴比妥酸 天津市光復(fù)精細化工研究所，分析純；D101大孔樹脂 天津市海光化工有限公司。

FA2004型分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 湖南星科科技有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；722型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1松多酚的提取和富集 精確稱取干燥粉碎過40目的脫脂樹皮5.00g，用60%乙醇在料液比為1∶30、超聲功率為150W、溫度為30℃條件下提取三次，過濾，真空濃縮到150mL，得到松多酚粗提液。將松多酚粗提液通過D101大孔樹脂進行富集，用60%乙醇洗脫，收集并濃縮洗脫液，得松多酚樣品。

1.2.2 還原能力的測定[14]取1mL樣品于試管中，依次加入2.5mL 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH6.6）和2.5mL 1%鐵氰化鉀[K3Fe（CN）6]溶液，混勻后于50℃水浴保溫20min后，快速冷卻，再加入2.5mL 10%三氯乙酸，離心10min，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL蒸餾水、0.5mL 0.1%三氯化鐵，充分混勻，在700nm下測其吸光度（以蒸餾水作調(diào)零空白）。

1.2.3 DPPH·清除能力測定[15]分別取不同濃度的松多酚樣品1mL及3mL、1×10-4mo1/L的DPPH溶液加入同一具塞試管中，搖勻后放置30min，以乙醇作參比，分別測定517nm處的吸光度A1。同時測定1mL不同濃度樣品與3mL乙醇混合后517nm的吸光度A2，再測定3mL DPPH溶液與1mL乙醇混合液517nm的吸光度A3。根據(jù)公式（1）計算DPPH·清除率。以VC作陽性對照。

清除率（%）=[1－（A1－A2）/A3]×1001）/A2]×100 式（1）

1.2.4 羥自由基清除能力測定[16]采用D-脫氧核糖-鐵體系法。體系中包含500μL KH2PO4-KOH緩沖溶液、100μL 5mmol/L FeCl3-EDTA混合液、100μL 10mmol/L的脫氧核糖溶液、100μL 10mmol/L的H2O2溶液、100μL 5mmol/L抗壞血酸溶液、100μL不同濃度的樣品。于37℃下水浴恒溫保持1h。然后加入2.8%三氯乙酸溶液1.00mL，1.0%硫代巴比妥酸溶液1.00mL，混勻后沸水浴中加熱10min，冰水冷卻后532nm處測定吸光值A(chǔ)1。不加樣品測定其吸光值A(chǔ)2。羥自由基清除率計算公式見式（2）。

清除率（%）=（A2－A1）/A2×100 式（2）

1.2.5 酚類物質(zhì)含量的測定

1.2.5.1 多酚含量的測定 參見文獻[17]。

1.2.5.2 黃酮含量的測定 參見文獻[18]。

1.2.5.3 原花青素含量的測定 參見文獻[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 還原能力

圖1 還原能力Fig.1 Reducing power

由圖1可以看出，紅松松多酚、紅皮云杉松多酚、VC的還原能力與濃度之間呈現(xiàn)出顯著的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2分別為：0.9849、0.9907、0.9992。紅皮云杉松多酚還原能力略高于紅松松多酚，與抗氧化劑VC的還原能力相比，在低濃度0～60μg/mL條件下，松多酚還原能力高于VC，當(dāng)濃度達到80μg/mL后，VC的還原能力逐漸高于松多酚。由表1可知，紅松松多酚、紅皮云杉松多酚和VC還原能力的EC50差異顯著（p＜0.05），EC50依次為（77.93±0.78）、（68.87±0.52）、（70.17±1.10）μg/mL。研究證實，一些植物提取物的抗氧化能力與還原能力之間具有很好的相關(guān)性，因此還原能力可以作為一種衡量抗氧化能力的指標(biāo)[20]。具有還原能力的物質(zhì)可以通過提供氫質(zhì)子將體系中鐵離子還原，從而抑制自由基的產(chǎn)生[4]，多酚類物質(zhì)正是氫質(zhì)子的提供者，因此松多酚含量越高其還原能力越強。

2.2 DPPH·清除能力

圖2 DPPH·清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity

由圖2可知，在濃度0～40μg/mL范圍內(nèi)，兩種松多酚清除DPPH·的能力相當(dāng)，并呈現(xiàn)良好的劑量依賴關(guān)系，顯示了較強的清除DPPH·的能力，在濃度達到40μg/mL以后，清除率曲線逐漸趨于平緩，紅松松多酚對DPPH·的清除能力逐漸高于紅皮云杉松多酚。同濃度的條件下，抗氧化劑VC清除DPPH·的能力顯著高于松多酚，抗氧化劑VC具有最低的清除DPPH·IC50為（13.72±0.21）μg/mL（表1），最高清除率可達到67.03%。紅松和紅皮云杉松多酚清除DPPH·IC50分別為（50.49±0.49）μg/mL和（54.67±0.75）μg/mL。DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，可以接受一個電子或一個質(zhì)子，形成更穩(wěn)定的物質(zhì)。DPPH·清除實驗是基于DPPH·接受抗氧劑的一個氫原子使奇數(shù)電子的氮原子減少從而引起體系中顏色的降低[17]，抗氧化劑清除DPPH·效果主要依賴于其供氫的能力。實驗數(shù)據(jù)表明，紅松和紅皮云杉松多酚清除DPPH·能力不及抗氧化劑VC。Van等[21]研究了南歐海松提取物碧螺芷PYC清除自由基的能力，發(fā)現(xiàn)碧螺芷PYC清除DPPH·的能力要高于兒茶素單體，證明了在抗氧化方面碧螺芷PYC各種組分之間存在協(xié)同增效的作用。兩種松科植物松多酚可以有效清除非生理自由基（DPPH·），因此可以猜測松多酚在預(yù)防自由基引發(fā)的連鎖反應(yīng)方面具有一定的作用[22]。

2.3 羥自由基清除能力

圖3 清除羥自由基能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging activity

清除DPPH·的模型是一種有用的檢測抗氧化潛能的指標(biāo)，然而這個模型不是用生物或者食品作為基質(zhì)，所以對于實際的抗氧化能力預(yù)測是受到限制的[23]。因此本研究以羥自由基引發(fā)脫氧核糖的損傷降解為基質(zhì)對松多酚的抗氧化能力進行評價。松多酚清除羥自由基能力如圖3所示。兩種松多酚清除羥自由基能力具有相同的趨勢，濃度在0～15μg/mL范圍內(nèi)，清除羥自由基的能力隨著濃度的增大迅速提高，呈顯著的劑量依賴關(guān)系，但是當(dāng)濃度達到15μg/mL以后，清除率變化緩慢，清除能力達到了最高限度。松多酚對Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基引起的脫氧核糖降解顯示極強的抑制作用，同濃度的條件下，兩種松多酚清除羥自由基的能力相當(dāng)，紅皮云杉松多酚略高于紅松松多酚，紅皮云杉松多酚清除能力高于紅松松多酚，但都強于水溶VE。由表1數(shù)據(jù)顯示，紅皮云杉松多酚和紅松松多酚具有較低的IC50（1.63±0.02）、（1.66±0.05）μg/mL，顯示極強的清除羥自由基的能力。數(shù)據(jù)表明，松多酚可以抑制由羥自由基損傷引起的脫氧核糖的降解，其原因體現(xiàn)在兩個方面，一是松多酚可以直接清除羥自由基，另一方面是松多酚可以阻斷Fenton反應(yīng)，減少了羥自由基的產(chǎn)生量[24]。

2.4 抗氧化活性的IC50（EC50）對比

還原能力、DPPH·清除能力和OH·清除能力的IC50（EC50）值，見表1。

表1還原能力、DPPH·清除能力和OH·清除能力的IC50（EC50）值Table 1IC50（EC50）of reducing power，DPPH·scavenging activity and OH·scavenging activity

注：不同小寫字母代表差異顯著，p＜0.05。

2.5 抗氧化活性成分分析

圖4 紅松和紅皮云杉樹皮中酚類物質(zhì)含量Fig.4 Phenolic compounds of pine bark of Pinus koraiensis and Picea koraiensis

松多酚是松科植物最主要的一類生物活性物質(zhì)，本研究對兩種松科植物（紅松、紅皮云杉）樹皮中的酚類物質(zhì)（多酚、黃酮、原花青素）含量進行比較。由圖4可知，紅松、紅皮云杉的樹皮總酚和原花青素的含量都較高，而黃酮的含量相對較低。紅松樹皮酚類物質(zhì)的含量均顯著高于紅皮云杉樹皮（p＜0.05），紅松樹皮總酚和原花青素的含量可分別達到（50.18±1.78）mgGAE/g干重和（39.51±0.72）mgGAE/g干重；紅皮云杉樹皮中總酚和原花青素的含量略低分別為：（38.09±1.38）mgGAE/g干重和（31.73±1.02）mgGAE/g干重。

3 討論

許多疾病如炎癥、缺血-再灌入損傷、動脈硬化、老年癡呆癥和帕金森癥都與活性氧引起的生物大分子損傷有關(guān)，是由自由基生成—清除體系不平衡導(dǎo)致的[25]。多酚抗氧化作用主要是通過直接清除自由基、抑制自由基的形成、激活抗氧化體系、促進機體抗氧化物質(zhì)的形成和與金屬離子螯合途徑實現(xiàn)的[26-27]。

對松科植物的研究已證實，松科植物樹皮提取物通常含有較高的單體酚和低聚原花青素（黃烷-3-醇聚合物）[28]。原花青素是松多酚的主要組成成分，原花青素的聚合度也是松樹提取物最重要的一個性質(zhì)，一方面影響抗氧化能力，低聚原花青素抗氧化能力隨聚合度的增加而增加[29]；另一方面也影響了原花青素的兩親性，Torres等[30]、Gaulejac等[31]研究證明，原花青素聚合度在2～4之間具有極好的兩親性（親水/疏水性）。

松多酚抗氧化性能主要依賴于分子中含有的酚羥基結(jié)構(gòu)。實驗證實鄰位酚羥基是抑制氧化過程中的主要還原部位，在抗氧化過程中，鄰位酚羥基作為氫供體，捕捉氧化過程中產(chǎn)生的自由基，而自身被氧化成穩(wěn)定醌類物質(zhì)，終止自由基引發(fā)的氧化進程[32]。在還原能力和DPPH·兩個體系中，松多酚表現(xiàn)的抗氧化活性主要依賴于松多酚的供氫能力，紅皮云杉松多酚抗氧化活性高于紅松松多酚，是由于前者原花青素占總酚的比例高于后者，原花青素B環(huán)上的鄰位酚羥基是供氫的主要位點。而在羥自由基體系中，松多酚主要通過直接清除羥自由基和阻止羥自由基生成兩條途徑來達到抑制脫氧核糖降解的作用，在這個體系中紅松松多酚抗氧化活性高于紅皮云杉松多酚，其原因可能是紅松松多酚中原花青素與酚酸、黃酮之間的協(xié)同增效作用效果強于紅皮云杉松多酚。

4 結(jié)論

兩種松科植物（紅松和紅皮云杉）樹皮松多酚體外抗氧化活性實驗結(jié)果表明，紅松松多酚和紅皮云杉松多酚具有較高的還原能力，可以有效地清除生理和非生理自由基（OH·、DPPH·）。還原能力和清除羥自由基的能力紅皮云杉松多酚活性強于紅松松多酚，清除DPPH·能力紅松松多酚活性高于紅皮云杉松多酚，結(jié)果表明，紅松和紅皮云杉樹皮松多酚是潛在的抗氧化劑和自由基清除劑。樹皮中酚類物質(zhì)（總酚、原花青素、黃酮）含量測定結(jié)果顯示，兩種樹皮中總酚和原花青素含量較高，黃酮的含量相對較低，紅松樹皮的酚類物質(zhì)含量顯著高于紅皮云杉樹皮（p＜0.05）。原花青素是松多酚的重要組成成分，其含量和結(jié)構(gòu)是影響松多酚抗氧化活性最主要的因素，此外松多酚各組分酚酸、黃酮和原花青素之間存在協(xié)同增效作用。

根據(jù)本課題的研究，松多酚具有較強的抗氧化活性，因此可以作為一種新的天然抗氧化劑，廣泛應(yīng)用在食品、化妝品、保健品和醫(yī)藥領(lǐng)域；紅松和紅皮云杉兩種松科植物的樹皮中富含多酚和原花青素，因此可以作為多酚和原花青素資源的重要來源。本研究只是對紅松和紅皮云杉兩種松科植物中松多酚的體外抗氧化活性和松多酚組分進行了初步的比較分析，為以后松多酚的深入研究奠定基礎(chǔ)。在以后研究過程中，進一步對松多酚的具體組成成分、原花青素的組分單位和聚合度進行分析，在抗氧化活性方面，體外與體內(nèi)實驗相結(jié)合，驗證松多酚可以通過激活抗氧化體系、促進機體自身抗氧化物質(zhì)形成與金屬離子螯合等途徑達到抗氧化的目的，進而闡明松多酚的抗氧化機制。

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