細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法動(dòng)態(tài)濁度法*

尹立平

(天津市寶坻區(qū)藥品檢驗(yàn)所，天津301800)

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法動(dòng)態(tài)濁度法*

尹立平

(天津市寶坻區(qū)藥品檢驗(yàn)所，天津301800)

查閱有關(guān)文獻(xiàn)資料，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法－動(dòng)態(tài)濁度法的原理、試劑要求、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、試驗(yàn)方法、應(yīng)用等方面做一歸納，總結(jié)了選用實(shí)驗(yàn)試劑注意問題、操作關(guān)鍵技巧、試驗(yàn)步驟、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和回收率計(jì)算方法及其在藥品檢驗(yàn)中的應(yīng)用。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，動(dòng)態(tài)濁度法，內(nèi)毒素，鱟試劑

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法也稱鱟試驗(yàn)法，用來判定供試品中內(nèi)毒素含量的限量是否符合規(guī)定的分析方法。目前，國(guó)內(nèi)外藥典收載的有凝膠法、濁度法和顯色法。2010年版《中國(guó)藥典》二部附錄中，將光度測(cè)定法中動(dòng)態(tài)濁度法收載為測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法之一。

1 實(shí)驗(yàn)原理

動(dòng)態(tài)濁度法是由內(nèi)毒素與鱟試劑的C因子反應(yīng)，被激活的凝固酶切斷凝固原蛋白中的精氨酸肽鏈，形成凝固蛋白，在產(chǎn)生凝膠過程中發(fā)生濁度變化，用濁度儀檢測(cè)反應(yīng)混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間，或是檢測(cè)濁度增加速度的方法。此方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)范圍廣(0.006～300 EU/ml)。

2 試驗(yàn)試劑

2.1 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品是保證試驗(yàn)的平行與重復(fù)性的重要參照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，主要分為工作標(biāo)準(zhǔn)品CSE和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品NS/RSE。日常檢驗(yàn)時(shí)，一般均使用廉價(jià)的工作標(biāo)準(zhǔn)品。動(dòng)態(tài)濁度定量法使用的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品要求穩(wěn)定性好，效價(jià)準(zhǔn)確，具有很好的重現(xiàn)性。內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋過程操作是試驗(yàn)關(guān)鍵，不正確操作會(huì)導(dǎo)致效價(jià)偏低，靈敏度標(biāo)示偏高、陽(yáng)性對(duì)照不凝等［1］。故而2010年《中國(guó)藥典》要求內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶解后，在旋渦混合器上混合15 min，以后每一步稀釋前最少混合30 s［2］。

2.2 鱟試劑內(nèi)毒素檢查法結(jié)果準(zhǔn)確度與所用鱟試劑的靈敏度關(guān)聯(lián)極大［3］，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時(shí)不能使用靈敏度值高于限值的鱟試劑。動(dòng)態(tài)濁度法應(yīng)該選用定量法鱟試劑，要求最低檢測(cè)限0.03～0.005 EU/ml?，F(xiàn)在市售的美洲鱟試劑(縮寫為L(zhǎng)AL)與東方鱟試劑(縮寫為TAL)，功效相同。國(guó)產(chǎn)定量專用TAL目前有KT、KTA系列。KTA最低檢測(cè)限達(dá)到0.005 EU/ml，可滿足于動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)需要。

2.3 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水試驗(yàn)中鱟試劑的溶解、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品及供試品的稀釋都要用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，不可以普通檢查用水代替。2010年版《中國(guó)藥典》明確要求動(dòng)態(tài)濁度測(cè)定法所用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水內(nèi)毒素含量小于0.005 EU/ml，且對(duì)內(nèi)毒素試驗(yàn)無(wú)干擾作用。

3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

3.1 內(nèi)毒素限值(L)的確定有兩種方法可以確定內(nèi)毒素限值(L)［4］:①依《中國(guó)藥典》規(guī)定:《中國(guó)藥典》2010年版中有規(guī)定檢查細(xì)菌內(nèi)毒素項(xiàng)的化學(xué)藥424個(gè)，生物制品39個(gè)品種的正文可以查到相應(yīng)的L值。②根據(jù)人的最大注射劑量:計(jì)算公式為L(zhǎng)=K/M，L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值(以EU/ml、EU/mg、EU/U表示)。K為人用按規(guī)定的給藥途徑不發(fā)生任何臨床不良反應(yīng)時(shí)，每kg體重每h最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/kg·h－1表示。靜脈(包括im，ip，SC，ia): 5.0 EU/kg·h－1;放射性藥品:2.5 EU/kg·h－1;鞘內(nèi): 0.2 EU/kg·h－1。M為人用每kg體重每h最大給藥劑量，以ml/kg·h－1、mg/kg·h－1、U/kg·h－1等表示，中國(guó)成人人均體重按60 kg計(jì)算，人體表面積按1.62 m2計(jì)算，注射時(shí)間小于1 h的按1 h計(jì)算。

3.2 最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時(shí)，當(dāng)內(nèi)毒素限值L=A值(鱟試劑靈敏度)時(shí)，經(jīng)干擾實(shí)驗(yàn)證實(shí)無(wú)干擾，可以直接檢查。當(dāng)L＞A值時(shí)，需要稀釋供試品，但稀釋的倍數(shù)不能超過最大有效稀釋倍數(shù)，用MVD表示。其計(jì)算公式為MVD=LC/λ，C為供試品溶液濃度，L為供試品的內(nèi)毒素限值，λ為動(dòng)態(tài)濁度法中所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低的內(nèi)毒素濃度。當(dāng)L以EU/mg、EU/U表示時(shí)，C的單位為mg/ml、U/ml;當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，C為1.0 EU/ml;當(dāng)供試品為注射用無(wú)菌粉末或原料藥時(shí)，MVD=1，可計(jì)算供試品的最小有效稀釋濃度C=λ/L。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)當(dāng)試驗(yàn)條件發(fā)生了改變或使用新批號(hào)的鱟試劑時(shí)，都可能會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果，此時(shí)需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來確認(rèn)試驗(yàn)的可靠性［5］。根據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》二部附錄要求，制備細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，例如2倍稀釋1.0、0.5、0.25、0.125和0.062 5 EU/ml，4倍稀釋2.00、0.50、0.125、0.031 25 EU/ml。將3個(gè)濃度的稀釋液，每一濃度的3支平行管的稀釋液各取適量分別加入到預(yù)先加有0.1 ml鱟試劑的實(shí)驗(yàn)管中，混合均勻，插入細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)做2支陰性對(duì)照。當(dāng)陰性對(duì)照在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)不發(fā)生反應(yīng)，將全部數(shù)據(jù)用最小2乘法進(jìn)行線性回歸分析。根據(jù)線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r≥0.980，證明試驗(yàn)有效，否則須重新試驗(yàn)。

3.4 干擾試驗(yàn)鱟試驗(yàn)法中為了確認(rèn)供試品的pH值、溫度、濃度及蛋白質(zhì)和一些非內(nèi)毒素雜質(zhì)等對(duì)內(nèi)毒素的檢測(cè)不產(chǎn)生干擾，無(wú)論新藥老藥在建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)需先做干擾試驗(yàn)，當(dāng)供試品的來源、配方、生產(chǎn)工藝改變或使用新批號(hào)鱟試劑等任何可能會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，都需重做干擾試驗(yàn)。

3.4.1 干擾預(yù)試驗(yàn)將供試品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水依次稀釋至2倍、4倍、8倍、16倍……，最后的稀釋倍數(shù)不得超過MVD，記為Ai液。一般不要以市售鱟試劑靈敏度計(jì)算所得的MVD作為起始濃度。注射液建議采用原液，粉針劑建議至少嘗試往上幾個(gè)濃度級(jí)，探索其干擾程度，如沒有干擾，方法則更可靠。以相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液加入標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)(或附近點(diǎn))濃度(設(shè)為λ1)的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，記為Bi液。分別取上述各液(每一濃度至少做3支平行管)適量加入預(yù)先加有0.1 ml TAL試劑的反應(yīng)管內(nèi)，混勻，立刻用細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)回歸處理，按所得線性回歸方程計(jì)算平均回收率。回收率(%)=(Bi液內(nèi)毒素值－Ai液內(nèi)毒素值)/λ1×100%。當(dāng)內(nèi)毒素的回收率在50%～200%之間，則認(rèn)為在該試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。當(dāng)內(nèi)毒素的回收率不在指定的范圍時(shí)，可用加熱、過濾、中和、透析等方法去除干擾因素(注意不要使供試品內(nèi)毒素失去活性)，重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。

3.4.2 正式干擾試驗(yàn)一般選擇干擾預(yù)試驗(yàn)中內(nèi)毒素回收率接近100%的最大不干擾濃度或最小稀釋倍數(shù)，即可用這一最大不干擾濃度進(jìn)行預(yù)干擾試驗(yàn)的驗(yàn)證。取不同廠家不同批號(hào)最少3批樣品制備下列供試液:①通過干擾預(yù)試驗(yàn)的供試品溶液，不加內(nèi)毒素，稀釋倍數(shù)不超過MVD;②加入標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)(或附近點(diǎn))的一個(gè)已知內(nèi)毒素濃度(設(shè)為λm)的供試品溶液，與①溶液稀釋倍數(shù)相同;③制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液，至少3個(gè)濃度(最低一點(diǎn)設(shè)為λ);④細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，不加內(nèi)毒素，作為陰性對(duì)照。按干擾預(yù)試驗(yàn)方法檢測(cè)，計(jì)算內(nèi)毒素回收率，如果回收率在50%～200%之間，則確認(rèn)在該試驗(yàn)條件下可進(jìn)行該供試品內(nèi)毒素檢查。

3.5 供試品檢查供試品為不同廠家不同批號(hào)最少3批，按干擾試驗(yàn)中的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。用溶液②中的內(nèi)毒素濃度減去溶液①中的內(nèi)毒素濃度，計(jì)算出的內(nèi)毒素的回收率，要在50%～200%的范圍內(nèi)。溶液④(陰性對(duì)照)反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間。用溶液③生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(溶液③的結(jié)果要符合r≥0.980的要求)計(jì)算溶液①的每一平行管的內(nèi)毒素濃度，若供試品溶液平行試驗(yàn)所得平均內(nèi)毒素濃度乘以稀釋倍數(shù)后，小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，則判定供試品符合規(guī)定;若大于或等于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判定供試品不符合規(guī)定。

4 應(yīng)用

《中國(guó)藥典》2010年版要求內(nèi)毒素檢查的化學(xué)藥品424個(gè)，生物制品39個(gè)，多采用鱟試劑凝膠法或凝膠半定量法，采用動(dòng)態(tài)濁度法定量測(cè)定的較少。近幾年儀器試劑的發(fā)展，技術(shù)的提高，有大量的文獻(xiàn)報(bào)道采用動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定細(xì)菌內(nèi)毒素含量。

4.1 化學(xué)藥化學(xué)藥類應(yīng)用動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定內(nèi)毒素含量報(bào)道較多，涉及到普通注射劑、抗菌藥物、原料藥和放射性藥品等，如詹云麗等［6］研究利巴韋林輸液中細(xì)菌內(nèi)毒素含量，采用動(dòng)態(tài)濁度法，結(jié)果表明將混合液稀釋至5倍后進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)是可行的。勞海燕等［7］對(duì)8種注射用頭孢菌素類抗生素定量稀釋，回收率為50%～200%，證實(shí)動(dòng)態(tài)濁度法可以高效的測(cè)定頭孢類藥物的內(nèi)毒素含量。顧炳仁等［8］將精氨酸原料藥配制成12.5 mg/ml的溶液時(shí)進(jìn)行動(dòng)態(tài)濁度定量測(cè)試效果滿意。王海云［9］對(duì)4種放射性藥品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，完成了動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定內(nèi)毒素含量。

4.2 中藥中藥注射劑成分復(fù)雜，干擾較多，苑慶華等［10］用細(xì)菌內(nèi)毒素動(dòng)態(tài)濁度法定量檢測(cè)柴胡注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，稀釋到32倍時(shí)排除干擾，回收率在50%～200%范圍內(nèi)，方法可行。黃桂勇等［11］使用細(xì)菌內(nèi)毒素的動(dòng)態(tài)濁度法可以高效地測(cè)定復(fù)方當(dāng)歸注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素含量。舒玉萍等［12］在復(fù)方苦參注射液細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢查法的實(shí)驗(yàn)探討中，供試液稀釋20倍無(wú)干擾，回收率50%～200%范圍內(nèi)，可應(yīng)用動(dòng)態(tài)濁度法定量測(cè)定其細(xì)菌內(nèi)毒素含量。

4.3 生物制品馬麗等［13］用動(dòng)態(tài)濁度法對(duì)胸腺肽進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定，結(jié)果可行。羅宇芬等［14］對(duì)β－七葉皂苷鈉通過動(dòng)態(tài)濁度法進(jìn)行干擾試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果16倍稀釋無(wú)干擾。賓漫容等［15］對(duì)腦組織注射液應(yīng)用動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素，結(jié)果回收率在50%～200%，證明可用動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定其內(nèi)毒素含量。

內(nèi)毒素動(dòng)態(tài)濁度法由于標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，最大限度地消除了內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，試驗(yàn)結(jié)果不受內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確性的影響，同時(shí)計(jì)算回收率更科學(xué)，對(duì)樣品干擾行為的描述更為準(zhǔn)確，結(jié)果可以保存，利于質(zhì)控，有可追溯性，尤其對(duì)于中藥注射劑，其定量意義更為重要。

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1006-5687(2014)01-0050-03

2013-12-03