實時熒光定量PCR技術(shù)在發(fā)育生物學實驗

靳 溪， 薛秀花， 李 潔， 向本瓊

(北京師范大學 生命科學學院， 北京 100875)

0 引 言

發(fā)育生物學是在傳統(tǒng)的胚胎學基礎(chǔ)上，綜合分子生物學、細胞生物學、遺傳學和生物化學等多學科, 逐漸發(fā)展起來的一門新興學科。主要研究多細胞生物體生殖細胞的發(fā)生、受精、胚胎的發(fā)育、生長、衰老和死亡，即研究生物胚胎發(fā)育和個體發(fā)育的機制[1-2]。隨著實驗技術(shù)的發(fā)展以及多學科的交叉融合，發(fā)育生物學研究進展迅速，這對發(fā)育生物學實驗課程提出了較高的要求。實驗課程的設(shè)計要理論與實踐并重，既需要與理論課程有一定的聯(lián)系，又要突出對于學生科學思維的訓練和分析問題、解決問題能力的培養(yǎng)。實驗教學是培養(yǎng)學生動手能力、科學思維和綜合素質(zhì)的重要措施，只有合理設(shè)置實驗教學內(nèi)容，才有可能提高實驗課程教學效果，實現(xiàn)培養(yǎng)全面人才的教學目標[3-4]。

實時熒光定量PCR (Real-time quantitative PCR) 是通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，在PCR反應過程中累積熒光信號，實時監(jiān)測PCR進程，對待測樣品起始模板量進行定量，可用于檢測和比較多種樣本中的微量核酸，包括：mRNA 表達分析、基因定量分析、點突變分析、等位基因分析、單核苷酸多態(tài)性分析、DNA 甲基化的檢測及對多種傳染病病原體的定量定性分析等。自1995年該技術(shù)問世以來，由于其具有快速、靈敏性高和特異性強等特點，已被廣泛應用于醫(yī)學診斷、生命科學、農(nóng)學、海關(guān)檢驗檢疫及國防軍事等領(lǐng)域的研究[5-7]。

我院自2007～2008學年秋季開始，為生物科學專業(yè)三年級本科生開設(shè)發(fā)育生物學實驗課程。該課程核心宗旨是通過實驗幫助學生理解發(fā)育生物學理論，提高學生自主實驗技能。對于每一學年的實驗課設(shè)置，任課教師都會結(jié)合課程要求和學生特點，安排新的實驗教學內(nèi)容。由于易于手術(shù)操作、便于觀察，雞胚是發(fā)育生物學研究的經(jīng)典實驗模型[8]。多年來，在我院發(fā)育生物學實驗動物部分課程中，雞胚是主要的實驗材料之一。近年來，實時熒光定量PCR技術(shù)的應用已十分普遍，雖然有些課程簡單介紹過該項技術(shù)，但均缺乏實踐操作環(huán)節(jié)。為了讓本科生從分子水平理解雞胚發(fā)育，同時，從理論到實踐全面了解實時熒光定量PCR技術(shù)，本學年設(shè)計了結(jié)合綜合性和探索性的實驗內(nèi)容應用于發(fā)育生物實驗課教學，以激發(fā)學生的獨立思考能力和自主學習積極性，提高學生的實踐能力和科學素養(yǎng)。實驗內(nèi)容教學效果良好。

1 教學安排

(1) 課時分配。樣品總RNA提取、鑒定、反轉(zhuǎn)錄模板共計8課時，實時熒光定量PCR實驗操作及結(jié)果分析共計8課時。

(2) 實驗分組。全班共4個小組，每個3或4人。

(3) 課程作業(yè)。授課前，要求學生預習定量PCR實驗，自學實驗原理。查閱文獻，假設(shè)一個與雞胚發(fā)育相關(guān)的待檢測基因，每組設(shè)計一個實驗方案。

實驗課上，講授實驗原理，提供一個標準的實驗方案讓學生進行操作，討論學生自己設(shè)計的實驗方案，給出意見和建議。

授課后，要求學生提交實驗報告，課上進行實驗結(jié)果交流和討論。

2 實驗材料與方法

2.1 實驗材料收集

在進行雞胚發(fā)育觀察實驗的同時，于雞胚發(fā)育的第10 d、15 d和20 d，每個小組在進行雞胚發(fā)育形態(tài)學觀察之后，分別采集雞胚的腦組織和心臟組織，收集于2 mL凍存管，放置液氮罐保存。

2.2 PCR模板樣品制備

(1) RNA提取。參照TIANGEN?動物組織總RNA提取試劑盒說明書。

(2) RNA濃度測定。GE?NanoVue。

(3) RNA純度測定。凝膠電泳。

(4) 反轉(zhuǎn)錄PCR。挑選經(jīng)過鑒定濃度和純度符合要求(凝膠電泳結(jié)果顯示條帶完整，OD260/OD280介于1.8～2.0)的RNA樣品進行反轉(zhuǎn)錄，參照TAKARA?反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書。

2.3 熒光定量PCR

(1) 引物[9-10](見表1)。

表1 引物信息

(2) 反應體系。滅菌水8 μL ，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，模板1 μL，定量Mix(2×)10 μL。

(3) 反應程序(ABI7500)。95℃ 5 min，95℃ 15 s—60℃ 30 s(循環(huán)數(shù)33)， 72℃ 35 s，熔解曲線分析程序。

(4) 結(jié)果分析。

3 實驗結(jié)果與分析

綜合全班實驗數(shù)據(jù)，實驗結(jié)果見圖1。

(1) 由于本實驗從樣本采集、RNA提取、鑒定、反轉(zhuǎn)錄到最后進行熒光定量PCR實驗步驟較多。實驗過程中，有的同學遺失樣本，有的同學提取的RNA質(zhì)量不合格，不能用于實時熒光定量PCR實驗，因此雞胚發(fā)育第10 d腦組織樣本實驗結(jié)果缺失。

(2) 目前應用雞胚作為實驗材料檢測發(fā)育階段GABAAreceptor γ3基因表達情況的文獻報道較少。本次學生實驗結(jié)果顯示，在雞胚腦組織中，該基因mRNA在雞胚發(fā)育第20 d比第15 d表達上調(diào)，這種表達變化的趨勢與Zaker等[10]研究報道一致。在雞胚心臟組織中，與雞胚發(fā)育第10 d相比，該基因mRNA在雞胚發(fā)育第15 d表達下調(diào)，第20 d表達上調(diào)。這些結(jié)果尚需重復實驗驗證才能得出結(jié)論。

圖1 實驗結(jié)果* 與10 d樣品相比，P<0.05；# 與15 d樣本相比，P<0.05

(3) 本次實驗是探索性教學實驗，由本科生為主體，綜合一系列實驗而最終獲得結(jié)果，并且只是全班進行了一次課堂上的實驗，匯總得到結(jié)果，可能存在實驗操作誤差。尚需重復實驗才能最終得出科研性結(jié)論。

4 教學意義

從課程建設(shè)和本科生教學實踐的角度考慮，此次實驗教學是成功的。通過該實驗的教學探索，為課程建設(shè)打下基礎(chǔ)，讓學生得到鍛煉和收獲。主要體現(xiàn)在以下幾點。

4.1 強化理論知識，鍛煉操作技能

通過實踐本實驗設(shè)計內(nèi)容，學生普遍反映與單純講授實時熒光定量PCR技術(shù)相比，通過實驗操作，對該技術(shù)有了更清晰的認識，不但理解了技術(shù)原理，還通過實際操作，學習了數(shù)據(jù)的分析方法。

學生通過預習、自主設(shè)計實驗、課堂實踐、實驗報告撰寫等環(huán)節(jié)，經(jīng)歷了一個相對完整、獨立的科研實驗過程，拓寬知識面，提高綜合實驗能力。通過這樣的實踐，有助于樹立學生的科學思維和嚴謹態(tài)度、鍛煉學生獨立思考、培養(yǎng)學生的創(chuàng)新能力。從樣品采集到最后的結(jié)果分析，該實驗設(shè)計包含了多個基本實驗，學生通過逐一完成每個實驗，了解了實驗基本原理，熟悉了操作步驟。既培養(yǎng)學生動手操作能力、科研分析及解決問題的能力，也充分調(diào)動了學生的積極性[11]。

在實驗中，學生會遇到各種各樣的問題，各個同學和小組之間要分工合作，這樣的過程，提供給學生一個發(fā)現(xiàn)問題、思考問題、解決問題的機會，激發(fā)學生學習興趣，培養(yǎng)學生的責任感和團隊合作精神。教學實踐中，學生成為實驗課程的主體，教師從旁輔導指引，充分調(diào)動學生的主動性、積極性和創(chuàng)造性。

4.2 合理安排實驗，善待實驗動物

實時熒光定量PCR技術(shù)應用于發(fā)育生物學實驗課，涉及到一系列的實驗和操作，這對學生的實驗設(shè)計和科研計劃能力提出了一定的要求。本實驗中，實驗材料的收集安排在雞胚發(fā)育觀察實驗之中，這訓練了學生科學管理實驗材料，合理利用實驗材料，規(guī)劃實驗時間安排的能力。在教學實踐中，出現(xiàn)學生忘記收集實驗材料，學生保存的實驗材料由于標記不清無法確定樣品來源，實驗步驟安排失誤導致實驗時間延長等各種情況，這對于學生都是很寶貴的教育過程。通過錯誤來學習是認知方式之一，課堂是學生獲得知識、鍛煉能力的場所，實驗課提供給學生的正是這樣的機會。通過實時熒光定量PCR實驗的教學實踐，一方面鍛煉了學生統(tǒng)籌實驗的能力；另一方面，幫助學生樹立善待實驗動物的理念，在進行完雞胚發(fā)育形態(tài)學觀察之后，收集實驗材料，既不會造成新的雞胚犧牲，還能充分利用已有實驗材料。

4.3 積累教學資源，完善課程設(shè)置

通過實時熒光定量PCR技術(shù)在發(fā)育生物學實驗的教學實踐，為發(fā)育生物學的綜合性實驗設(shè)計及探索性實驗項目提供參考。雞胚發(fā)育實驗是我院開設(shè)發(fā)育生物學以來一直很重視的實驗內(nèi)容之一，如何豐富該實驗的內(nèi)容，使學生更好的理解發(fā)育原理一直是發(fā)育生物學實驗課程希望完善之處。通過本次教學實踐，為學生從分子水平觀察雞胚發(fā)育提供了可能。

發(fā)育生物學實驗是我院生物科學專業(yè)本科生在本科階段最后一門實驗課程，之所以安排在大三學年，就是因為發(fā)育生物學實驗是一門綜合性很強的課程，并且，正處于快速發(fā)展階段，新的研究技術(shù)和方法不斷被應用、新的理論觀點不斷被提出。因此，就要求任課教師思考如何合理有效的設(shè)置課程，既要考慮到與理論課程的有機結(jié)合，也要兼顧發(fā)育生物學實驗的綜合性。

將實驗技術(shù)應用于科研，其可操作性相對較強，但要使其成為實驗課的教學實驗，需要經(jīng)過不斷的摸索和改進，使之適應教學實驗的特點[12-13]。本次實踐為以后在發(fā)育生物學實驗課設(shè)計開展實時熒光定量PCR實驗模塊奠定了基礎(chǔ)。只有不斷嘗試，勇于開拓，才能將理論與實踐、科學研究與教學實驗更好地結(jié)合。

5 結(jié) 語

在生命科學快速發(fā)展的今天，發(fā)育生物學實驗課程面臨著機遇和挑戰(zhàn)。為培養(yǎng)全面發(fā)展的高素質(zhì)本科人才，教師要不斷更新教育教學理念，不斷創(chuàng)新教學方式方法，課前要認真研究課程內(nèi)容，基于學生已有知識基礎(chǔ)，合理設(shè)置實驗課的教學內(nèi)容，積極了解學生反饋意見，并進行必要的調(diào)整。從而改善教學質(zhì)量，鍛煉學生的綜合能力，提高教師的業(yè)務能力和科研水平，形成教學相長良性互動的局面，以適應新時期人才培養(yǎng)和社會發(fā)展的需求[14-16]。唯有經(jīng)過不懈努力和持久開拓，才能實現(xiàn)發(fā)育生物學實驗課程的日臻完善。

(致謝:感謝北京師范大學生命科學學院翟永功教授對本實驗設(shè)計和實施方案提供的意見和建議。感謝北京師范大學生命科學學院張雁云教授在文章發(fā)表過程中給予的支持和幫助。感謝研究生助教許鵬飛和樊蓉在預實驗和課堂教學時的協(xié)助指導。)

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