“中藥色譜分析綜合實(shí)驗(yàn)”創(chuàng)新課程教學(xué)探索

周婷婷， 聞 俊， 趙衛(wèi)權(quán)， 洪戰(zhàn)英， 趙 鑫， 范國榮

(1. 第二軍醫(yī)大學(xué) 藥學(xué)院，上海 200433；2. 上海市藥物(中藥)代謝產(chǎn)物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433)

0 引 言

分析化學(xué)是關(guān)于研究物質(zhì)的組成、含量、結(jié)構(gòu)和形態(tài)等化學(xué)信息的分析方法及相關(guān)理論的一門科學(xué)，其理論知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技能是藥物分析學(xué)、藥物化學(xué)、天然藥物化學(xué)、中藥學(xué)等各個(gè)學(xué)科的必備基礎(chǔ)，是藥學(xué)專業(yè)基礎(chǔ)化學(xué)課程之一[1]。分析化學(xué)以解決實(shí)際問題為目的，實(shí)踐性、應(yīng)用性較強(qiáng)，因此配合理論教學(xué)所開設(shè)的分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)可以鞏固加深學(xué)生對(duì)分析化學(xué)基本概念和理論的理解，同時(shí)又使得學(xué)生可以運(yùn)用所學(xué)的知識(shí)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)過程、解釋實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和解決實(shí)驗(yàn)中的問題，做到理論聯(lián)系實(shí)際。

針對(duì)藥學(xué)專業(yè)學(xué)生的分析化學(xué)教學(xué)，多采用藥物為對(duì)象進(jìn)行理論和實(shí)驗(yàn)講授，以在低年級(jí)階段讓學(xué)生接觸藥物的概念，盡早的強(qiáng)化學(xué)生藥學(xué)專業(yè)思想，即所學(xué)的理論知識(shí)與實(shí)驗(yàn)技術(shù)是用來解決藥物研究的實(shí)際問題。從這個(gè)角度出發(fā)，實(shí)驗(yàn)教學(xué)不應(yīng)該全部以獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行訓(xùn)練，可以采用模塊化的實(shí)驗(yàn)教學(xué)形式，以解決實(shí)際問題為目的，合理進(jìn)行教學(xué)設(shè)計(jì)，有機(jī)組合實(shí)驗(yàn)技術(shù)，突出科學(xué)實(shí)踐過程，在訓(xùn)練學(xué)生實(shí)驗(yàn)技能的基礎(chǔ)上，有效的訓(xùn)練學(xué)生科研思維，增加學(xué)生專業(yè)興趣[2-4]。因此，我們改進(jìn)了色譜分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，建立了以“中藥有效成分提取分離及分析”為主的色譜分析模塊的綜合實(shí)驗(yàn)，并且在近7屆學(xué)生中進(jìn)行了教學(xué)實(shí)踐加以不斷完善，達(dá)到了較好的教學(xué)效果，構(gòu)建了以提高學(xué)生分析問題、解決問題能力和增加專業(yè)學(xué)習(xí)興趣的模塊化實(shí)驗(yàn)教學(xué)新模式。

1 色譜分析教學(xué)模塊

分析化學(xué)中色譜分析教學(xué)模塊主要由色譜分析概論、氣相色譜法、高效液相色譜法、平面色譜法組成，其中概論部分以經(jīng)典的柱色譜為例，講授了色譜流出曲線、分離機(jī)制和色譜基本理論；各論中以各個(gè)色譜法的原理與應(yīng)用特點(diǎn)為主進(jìn)行講解?！笆鞘裁?？能做什么？”是教師通過課堂教學(xué)后，期望告訴學(xué)生的內(nèi)容。其中“能做什么？”的答案則是以模塊化的中藥色譜分析為面貌展現(xiàn)在學(xué)生面前，結(jié)合理論課中“是什么？”的原理探討，使學(xué)生在實(shí)驗(yàn)中增加對(duì)儀器使用和方法應(yīng)用的直觀認(rèn)知過程[5-6]。

根據(jù)理論課教學(xué)中需要掌握的方法原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)，我們將色譜實(shí)驗(yàn)分為柱色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法4個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。模塊化的綜合實(shí)驗(yàn)則是基于中藥分析這一實(shí)驗(yàn)過程提出的，中藥分析中如何將上述4種實(shí)驗(yàn)技術(shù)有機(jī)結(jié)合，在教學(xué)設(shè)計(jì)中需要老師仔細(xì)考慮。根據(jù)教學(xué)組多年來“科研反哺教學(xué)”這一教學(xué)理念，結(jié)合教研室在中藥質(zhì)量控制中的研究技術(shù)與科研成果[7-14]，我們提出以“中藥有效成分提取分離及分析”為實(shí)驗(yàn)教學(xué)要求的中藥色譜分析綜合實(shí)驗(yàn)，形成了“柱色譜法分離純化中藥有效部位”，“薄層色譜法鑒識(shí)粗提物及有效部位中活性成分”，“氣相色譜法檢查有效部位中有機(jī)溶劑殘留量”，“高效液相色譜法測(cè)定有效部位及藥材中活性成分含量”這4個(gè)前后聯(lián)系，以解決中藥分析問題為主線的創(chuàng)新型教學(xué)設(shè)計(jì)。創(chuàng)新的模塊化實(shí)驗(yàn)教學(xué)不僅對(duì)4種色譜實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行綜合運(yùn)用，而且還囊括了分離制備、定性和定量分析這些應(yīng)用特點(diǎn)，同時(shí)也給學(xué)生一些科研實(shí)踐的思考：柱色譜分離純化過程對(duì)有效部位中活性成分含量是否有影響？有機(jī)溶劑殘留主要和哪幾個(gè)步驟有關(guān)？有效部位和藥材中活性成分含量為何會(huì)有不同？這些都能夠激發(fā)學(xué)生的探求欲和主觀能動(dòng)性，初步具備實(shí)踐研究的思維特點(diǎn)。

2 藥材及實(shí)驗(yàn)方法的綜合選擇

中藥屬于藥物分析中的復(fù)雜體系，色譜法以其分離分析的特點(diǎn)，當(dāng)仁不讓的成為中藥分析的首選方法。但是我國中藥材種類豐富，其中所含的活性成分也千差萬別，具體實(shí)驗(yàn)方法也不盡相同，因此教學(xué)組老師從自身科研角度出發(fā)，同時(shí)也綜合考慮學(xué)生實(shí)驗(yàn)過程中的課時(shí)安排、儀器與試劑使用、對(duì)照品價(jià)格等問題，篩選了實(shí)驗(yàn)室研究較多的中藥為對(duì)象，表1列出了該實(shí)驗(yàn)中選擇的藥材及實(shí)驗(yàn)方法。

學(xué)生實(shí)驗(yàn)與科研過程存在區(qū)別。如何在有限的教學(xué)時(shí)數(shù)、設(shè)備資源配置和教學(xué)經(jīng)費(fèi)投入中，獲得預(yù)期的教學(xué)目標(biāo)，提高教學(xué)質(zhì)量，是教學(xué)設(shè)計(jì)者需要考慮的問題。在最初的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，我們分別在3個(gè)不同年級(jí)中嘗試了采用辛夷、金蓮花和山楂葉進(jìn)行有效成分的分離純化、定性定量分析。雖然整個(gè)教學(xué)過程可以完整的實(shí)施，但是其中的問題卻反映出“科研反哺教學(xué)”這一理念在付諸實(shí)踐時(shí)，還需要符合本科生的認(rèn)知程度和實(shí)驗(yàn)教學(xué)的要求。

辛夷中的木脂素成分極性較小，采用大孔吸附樹脂分離純化，需要60%～90%的乙醇才能洗脫，柱色譜分離時(shí)間變長；為了保證高效液相色譜基線分離，針對(duì)松脂素二甲醚選擇的流動(dòng)相體系使得整個(gè)分析時(shí)間為30 min。金蓮花和山楂葉純化后的總黃酮有效部位中除了表1中所列主要活性成分外，還有較多的其他黃酮苷類成分，成分越多色譜方法優(yōu)化就越復(fù)雜，條件也會(huì)更加苛刻。例如金蓮花總黃酮有效部位中葒草苷定量分析，高效液相色譜流動(dòng)相組成復(fù)雜，不僅學(xué)生配制過程容易出錯(cuò)，而且較長的分析周期也使得實(shí)驗(yàn)變得冗長。除此以外，對(duì)照品獲得成本也需要考慮在實(shí)驗(yàn)中。由于學(xué)生實(shí)驗(yàn)需要自行配制工作曲線溶液，因此葒草苷與牡荊素鼠李糖苷化學(xué)對(duì)照品總量的成本顯得相當(dāng)高，而自制對(duì)照品的成本與周期也并不省時(shí)省力，從效率說上考慮，實(shí)驗(yàn)教學(xué)的有效性便大打折扣。

表1 中藥色譜分析模塊綜合實(shí)驗(yàn)藥材與主要實(shí)驗(yàn)方法

*氣相色譜條件：色譜柱：SPB-1(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細(xì)管柱，初始柱溫50 ℃；程序升溫：50 ℃恒溫3 min，而后40 ℃/min升溫至230 ℃，并維持5 min；進(jìn)樣口溫度230 ℃；FID檢測(cè)，檢測(cè)器溫度250 ℃；以高純氮為載氣，柱前壓力為48 kPa，分流比為30∶1；溶液直接進(jìn)樣，進(jìn)樣量為0.5 μL

**色譜柱規(guī)格為150 mm×4.6 mm，5 μm，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL；分析周期指“對(duì)照品”分析周期

相比之下，梔子純化后得到的有效部位成分簡(jiǎn)單，其中梔子苷含量達(dá)到了60%以上，薄層色譜條件可以直接采用藥典的方法，高效液相色譜法流動(dòng)相組成簡(jiǎn)單，分析周期短。實(shí)驗(yàn)室擁有梔子苷單體制備的專利[13]，而且每個(gè)年級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)后收集的剩余有效部位經(jīng)過進(jìn)一步簡(jiǎn)單制備后又可以得到梔子苷對(duì)照品，如此循環(huán)利用不僅避免了藥材浪費(fèi)，還獲得了更多的梔子苷對(duì)照品，使得實(shí)驗(yàn)教學(xué)具有可持續(xù)性。因此從藥學(xué)本科2007年級(jí)開始至今，我們便選擇梔子藥材中總環(huán)烯醚萜苷類有效成分分離純化和定性定量分析為教學(xué)內(nèi)容，進(jìn)行中藥色譜分析模塊綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)，通過不斷的完善，目前已經(jīng)基本可以滿足教學(xué)要求，取得了較大的教學(xué)效果。

3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

3.1 梔子中環(huán)烯醚萜苷類成分的提取及柱色譜法分離純化

干燥梔子藥材100 g，用10倍量50%乙醇80 ℃回流提取兩次，每次2 h，過濾，合并濾液，40℃減壓濃縮至120 mL，離心除去沉淀，得到含有梔子環(huán)烯醚萜苷有效部位的提取液(預(yù)留10 mL供以后實(shí)驗(yàn)使用)。上述步驟由老師提前完成。取剩余提取液，加入裝有400 g經(jīng)過預(yù)處理的1 300大孔吸附樹脂層析柱上，上樣完畢后吸附1 h。用1 000 mL水進(jìn)行淋洗，淋洗液棄去。再用3 000 mL 20%乙醇洗脫，收集洗脫液減壓濃縮，真空干燥(60 ℃)，得環(huán)烯醚萜苷有效部位固體產(chǎn)品。環(huán)烯醚萜苷有效部位得率=(固體產(chǎn)品重量÷藥材重量)×100%。

實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)徑為3 cm的玻璃柱，樹脂填裝應(yīng)均勻緊密；上樣時(shí)注意防止樣品快速傾倒下沖起樹脂產(chǎn)生柱內(nèi)氣泡，影響分離效果。運(yùn)用乙醇密度計(jì)測(cè)定所配制的乙醇的濃度；淋洗及洗脫過程需要控制流速，一般為25～30 mL/min，防止流速太快造成淋洗或洗脫不完全，帶入較多雜質(zhì)，降低產(chǎn)品得率。

3.2 梔子中環(huán)烯醚萜苷類成分的薄層色譜法鑒別

取硅膠粉末5 g于研缽中，分多次加入0.5% CMC-Na溶液10 mL，每次加入后充分研勻，調(diào)成糊狀，均勻涂布在玻璃板上，置水平臺(tái)面上于室溫下晾干，再在105 ℃烘箱中活化60 min，儲(chǔ)于干燥器中備用。上述步驟在前一個(gè)實(shí)驗(yàn)的樣品吸附1 h期間完成。

分別將梔子藥材粗提液和有效部位用50%甲醇溶解并稀釋成約相當(dāng)于原藥材200 mg/mL的供試品溶液，梔子苷對(duì)照品用乙醇溶解配制成約4 mg/mL的濃度，作為對(duì)照品溶液。取供試品溶液及對(duì)照品溶液，分別點(diǎn)于自制硅膠上，點(diǎn)樣基線距薄層板底邊2 cm，點(diǎn)樣原點(diǎn)直徑應(yīng)小于2 mm，各樣品原點(diǎn)之間間距1.5 cm以上，點(diǎn)樣量約5 μL。另取市售硅膠板，同法操作。

按照乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)比例配制展開劑，倒入層析缸內(nèi)，待點(diǎn)樣后斑點(diǎn)溶劑揮干后，將薄層板放入層析缸內(nèi)飽和15 min，而后將薄層板下緣浸入展開劑中約0.5～1 cm(展開劑切勿浸沒樣品原點(diǎn))，展開約20～30 min后取出，標(biāo)記展開劑前沿，放在空氣中揮干。展開劑揮干后，噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃烘箱內(nèi)加熱至斑點(diǎn)清晰。

比較供試品和對(duì)照品展開后的斑點(diǎn)，測(cè)量計(jì)算Rf值。

3.3 高效液相色譜法測(cè)定梔子藥材及其提取物中梔子苷的含量

配制500 ml流動(dòng)相，比例為乙腈-1%醋酸水(15∶85)，色譜柱為ODS柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，設(shè)置色譜儀條件為流速1.0 ml/min，室溫，檢測(cè)波長238 nm，進(jìn)樣量20 μl。

取梔子苷對(duì)照品，精密稱定，用50%甲醇配制約1 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液；取梔子苷儲(chǔ)備液適量，置5 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋并定容，制成濃度為10、20、40、60、80 μg/mL的梔子苷對(duì)照品工作曲線系列溶液。

精密量取梔子藥材提取液適量，置10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋并定容；精密稱定有效部位粉末適量，置10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋并定容，制成相當(dāng)于原藥材2 mg/mL的供試品溶液。臨用前用0.45 μm微孔濾膜過濾。

在上述色譜條件下，依次進(jìn)樣工作曲線溶液，以對(duì)照品溶液的濃度(c)和相應(yīng)的色譜峰面積(A)，擬合A-c工作曲線，求算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。進(jìn)樣供試品溶液，分別將色譜峰面積代入回歸方程中，求算濃度，并進(jìn)而求算藥材及有效部位中梔子苷的含量，梔子苷經(jīng)過大孔吸附樹脂分離純化后的得率。

3.4 氣相色譜法檢查梔子環(huán)烯醚萜苷類有效部位中的殘留溶劑

氣相色譜實(shí)驗(yàn)條件為色譜柱：SPB-1(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細(xì)管柱，初始柱溫50 ℃，程序升溫：50 ℃恒溫3 min，而后40 ℃/min升溫至230 ℃，并維持5 min；進(jìn)樣口溫度230 ℃；FID檢測(cè)，檢測(cè)器溫度250 ℃；以高純氮為載氣，柱前壓力為48 kPa，分流比為30∶11；溶液直接進(jìn)樣，進(jìn)樣量為0.5 μL。

精密稱取乙醇、正丁醇適量，用N, N-二甲基甲酰胺為溶劑，分別配制乙醇與正丁醇儲(chǔ)備液約10 mg/mL。分別量取上述二者儲(chǔ)備液適量，置同一10 mL量瓶中，用N, N-二甲基甲酰胺稀釋并定容，制成乙醇和正丁醇濃度均為0.5 mg/mL的對(duì)照品溶液。

精密稱取梔子有效部位適量，置10 mL量瓶，并同時(shí)精密加入正丁醇儲(chǔ)備液適量，用N, N-二甲基甲酰胺稀釋并定容，制成梔子環(huán)烯醚萜苷有效部位0.1 g/mL和正丁醇0.5 mg/mL的供試品溶液。

按上述色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，峰面積內(nèi)標(biāo)法計(jì)算梔子有效部位中乙醇?xì)埩袅?，檢查有機(jī)溶劑殘留是否符合標(biāo)準(zhǔn)。

4 實(shí)驗(yàn)實(shí)施

上述每個(gè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)時(shí)間安排為4學(xué)時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器設(shè)備數(shù)量，學(xué)生分組實(shí)施實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，每組5～8人為宜。按照中藥有效成分提取分離、定性定量分析的順序，所有小組同時(shí)開展實(shí)驗(yàn)，每次完成1個(gè)項(xiàng)目。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組安排1名老師和1名高年級(jí)研究生帶教，同時(shí)印發(fā)儀器使用基本操作規(guī)程，以幫助學(xué)生掌握色譜儀器的基本使用。

為了盡可能減少4個(gè)色譜實(shí)驗(yàn)以外的因素影響有效部位提取效率，結(jié)合實(shí)驗(yàn)教學(xué)時(shí)數(shù)安排，由老師在課前，根據(jù)學(xué)生分組個(gè)數(shù)，放大量統(tǒng)一完成梔子藥材提取。學(xué)生柱色譜中獲得的3 000 mL 20%乙醇洗脫液，則由老師在課后分別減壓濃縮，制備成有效部位固體粉末，此粉末即為后續(xù)色譜分析實(shí)驗(yàn)的供試品之一，其得率由學(xué)生課堂內(nèi)自行計(jì)算。

實(shí)驗(yàn)過程中強(qiáng)調(diào)認(rèn)真記錄原始記錄，包括與柱色譜分離相關(guān)的洗脫液的體積和流速，淋洗及洗脫過程中層析柱上顏色的變化；薄層色譜法中點(diǎn)樣體積、展開時(shí)間、點(diǎn)樣原點(diǎn)到斑點(diǎn)的距離；高效液相色譜法中柱壓的變化、分析對(duì)象的保留時(shí)間和峰面積；氣相色譜法中載氣、氫氣和空氣的壓力及流速，溫度變化與待測(cè)成分保留時(shí)間，色譜峰面積等。詳實(shí)的記錄一方面可以讓學(xué)生了解色譜分析中的關(guān)鍵步驟，一方面便于在最后比較各組結(jié)果時(shí)，找出各組間結(jié)果不同的原因。

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以2010年級(jí)本科某組實(shí)驗(yàn)結(jié)果為例：100 g梔子果實(shí)藥材，經(jīng)過50%乙醇回流提取，并經(jīng)過大孔吸附樹脂分離純化后得到棕色的環(huán)烯醚萜苷有效部位5.301 g。薄層色譜法鑒別結(jié)果顯示，梔子果實(shí)粗提液及環(huán)烯醚萜苷有效部位的薄層色譜圖中均顯示與梔子苷位置相同，顏色相近的斑點(diǎn)，表明粗提液和有效部位中含有梔子苷。自制硅膠板與商品化硅膠板的結(jié)果一致。

采用高效液相色譜法測(cè)定梔子果實(shí)粗提液及環(huán)烯醚萜苷有效部位中梔子苷含量，在上述色譜條件下，梔子苷保留時(shí)間約為5.2 min，理論塔板數(shù)大于3 000。以梔子苷對(duì)照品溶液濃度(c，μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，求得梔子苷的線性回歸方程為：A=6 262c-288，r=0.999 9，表明梔子苷在10～80 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。計(jì)算得出梔子果實(shí)藥材中梔子苷含量為39.1 mg/g，環(huán)烯醚萜苷有效部位中梔子苷含量為591.7 mg/g，其中以梔子苷計(jì)算轉(zhuǎn)移率為80.4%。采用氣相色譜法測(cè)定環(huán)烯醚萜苷有效部位中乙醇?xì)埩袅?，采用?nèi)標(biāo)峰面積比值法測(cè)定，有效部位中乙醇?xì)埩袅啃∮?.5%，結(jié)果合格。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，教師要求每個(gè)同學(xué)按照期刊論文的格式撰寫一篇研究論文，其中柱色譜分離純化模塊屬于藥材提取部分，必須寫入論文，其余的3個(gè)模塊則由同學(xué)自由選擇組合后寫入論文中。論文完成后學(xué)生還需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及實(shí)驗(yàn)過程中遇到的問題制作實(shí)驗(yàn)研究電子幻燈進(jìn)行匯報(bào)，對(duì)中藥提取分離及色譜定性、定量分析進(jìn)行深入的探討與交流。特別是針對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果相差較大的實(shí)驗(yàn)小組，在匯報(bào)交流過程中與學(xué)生一起進(jìn)行溯源式分析，提出可能影響結(jié)果的實(shí)驗(yàn)操作步驟，在對(duì)色譜綜合分析具有直觀而整體印象的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行每個(gè)色譜技術(shù)的回顧，使專業(yè)知識(shí)的掌握與應(yīng)用更加牢固。

6 結(jié) 語

中藥色譜分析綜合實(shí)驗(yàn)充分考慮了學(xué)生學(xué)習(xí)過程的需求，從色譜理論出發(fā)層層遞進(jìn)，以不同的色譜實(shí)驗(yàn)技術(shù)為手段，中藥為研究對(duì)象，以解決實(shí)際問題為出發(fā)點(diǎn)，為本科生提供了一個(gè)全面而扎實(shí)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)平臺(tái)。特別是教學(xué)組在中藥質(zhì)量控制等科研工作上的優(yōu)勢(shì)積累，反哺于本科生的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中[15]，在強(qiáng)化藥學(xué)專業(yè)思想的同時(shí)，也使學(xué)生在類科研的環(huán)境中進(jìn)行綜合性實(shí)驗(yàn)，不僅訓(xùn)練了學(xué)生色譜分析的實(shí)驗(yàn)技能，而且提高了學(xué)生綜合運(yùn)用知識(shí)分析問題和解決問題的能力，更能夠提升學(xué)生對(duì)專業(yè)領(lǐng)域內(nèi)熱點(diǎn)的興趣，為今后專業(yè)課程的研修和實(shí)踐，奠定了良好的理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)技能。

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