紅樹林沉積物中產(chǎn)氫微生物的分離鑒定和性能分析

朱大玲，楊振芳，潘光華

(天津市海洋化學(xué)與資源重點實驗室，天津科技大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457)

紅樹林沉積物中產(chǎn)氫微生物的分離鑒定和性能分析

朱大玲，楊振芳，潘光華

(天津市海洋化學(xué)與資源重點實驗室，天津科技大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457)

采用厭氧富集三層平板和螺口試管培養(yǎng)法，根據(jù)產(chǎn)氣特征從紅樹林沉積物中篩選分離海水條件下的高效產(chǎn)氫菌株，獲得1株兼性厭氧具有較高產(chǎn)氫能力的菌株BH-16．通過形態(tài)觀察、Biolog鑒定和16S rDNA序列分析，該菌株鑒定為摩氏摩根氏菌BH-16．實驗表明：在厭氧培養(yǎng)條件下，菌株BH-16的最適起始pH、NaCl質(zhì)量濃度和培養(yǎng)溫度分別為8.0、0.01 g/mL、37,℃．通過間歇產(chǎn)氣實驗和氣相色譜分析對菌株的產(chǎn)氫能力進(jìn)行分析，結(jié)果表明：菌株BH-16大量產(chǎn)氫發(fā)生在細(xì)胞指數(shù)生長后期和細(xì)胞生長平穩(wěn)期；在海水培養(yǎng)條件下，在起始葡萄糖質(zhì)量濃度為20 g/L、起始pH為7.2時，菌株的總產(chǎn)氫量和平均產(chǎn)氫速率分別為1,120 mL/L和93.3 mL/(L·h)．

紅樹林沉積物；摩氏摩根氏菌；分離鑒定；發(fā)酵產(chǎn)氫

氫氣以清潔、可再生等特點被認(rèn)為是最有希望的石油燃料替代品．與熱化學(xué)或是電化學(xué)制氫過程相比，生物制氫過程因其對環(huán)境友好，投入能量少等特點而倍受關(guān)注[1]．生物制氫主要為光合生物制氫和非光合生物制氫．其中，暗發(fā)酵微生物制氫可以在無光條件下厭氧發(fā)酵制氫，使得生物反應(yīng)器的設(shè)計較光合微生物制氫簡單，應(yīng)用前景更廣．已報道的暗發(fā)酵產(chǎn)氫微生物有腸桿菌(Enterobacter)、芽胞桿菌(Bacillus)、梭菌(Clostridium)、成團(tuán)泛菌(Pantoea)等[2–6]，其中部分是專性厭氧菌，部分是兼性厭氧菌．與專性厭氧菌相比，兼性厭氧菌對氧氣的不敏感性使其在培養(yǎng)和應(yīng)用方面表現(xiàn)出很大的優(yōu)勢．截至

目前，對產(chǎn)氫細(xì)菌的報道主要集中在淡水領(lǐng)域，有關(guān)海水或高鹽環(huán)境的產(chǎn)氫微生物報道相對較少．

我國的海水養(yǎng)殖業(yè)居世界第一．采用的集約化養(yǎng)殖模式使得海水養(yǎng)殖廢水有機(jī)質(zhì)和氨氮含量超標(biāo)嚴(yán)重，這些養(yǎng)殖廢水的直接排放勢必使得當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境質(zhì)量降級[7]．更甚者，沿岸海域的富營養(yǎng)化常導(dǎo)致有害水華的發(fā)生，所以對海水養(yǎng)殖有機(jī)廢水處理是非常必要的．此外，因淡水資源的短缺，部分沿海城市直接利用海水作為工業(yè)用水或是生活用水，由此也將產(chǎn)生大量的高鹽有機(jī)廢水，在排放之前也需進(jìn)行處理.目前，厭氧處理有機(jī)物產(chǎn)生氫氣和二氧化碳來處理淡水有機(jī)廢水和廢物的技術(shù)已經(jīng)比較成熟[8]，因此利用海洋廢水和有機(jī)廢物進(jìn)行微生物制氫技術(shù)在理論上是可行的．而利用海水養(yǎng)殖廢水或高鹽有機(jī)廢水進(jìn)行發(fā)酵制氫的前提條件是產(chǎn)氫海洋細(xì)菌或產(chǎn)氫耐鹽細(xì)菌的篩選．

許多研究報道從淡水環(huán)境中篩選產(chǎn)氫微生物，例如城市垃圾、下水道污泥和池塘污泥等[2–3]．而分離自海洋環(huán)境或是高鹽環(huán)境的產(chǎn)氫微生物的研究報道較少．在多種多樣的海洋環(huán)境中，紅樹林沉積物是用來篩選產(chǎn)氫微生物的良好材料．紅樹林是位于熱帶和亞熱帶的一類特殊的生態(tài)環(huán)境[9]，其沉積物營養(yǎng)非常豐富、微氧及鹽度梯度變化等特點使得該底泥中細(xì)菌種群呈多樣性分布．本研究從紅樹林沉積物中分離獲得了1株海水暗發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌，采用16S rDNA序列分析和Biolog鑒定方法對該菌株進(jìn)行鑒定，并對其培養(yǎng)條件和產(chǎn)氫能力進(jìn)行了分析，以期為利用海水養(yǎng)殖有機(jī)廢水或高鹽有機(jī)廢水進(jìn)行微生物發(fā)酵產(chǎn)氫提供候選產(chǎn)氫菌株．

1 材料與方法

1.1 樣品來源

實驗用沉積物采自我國廣西省北海市(108°50′～109°47′E，21°29′～21°55′N)的紅樹林保護(hù)區(qū)潮間帶．采樣點處于低潮帶、離地表30～40,cm處．采樣后污泥密封4,℃保存，維持細(xì)菌種群的多樣性．

1.2 培養(yǎng)基

菌群富集和菌株分離所用培養(yǎng)基LM-H，根據(jù)李永峰等[10]LM-1培養(yǎng)基進(jìn)行改良(g/L)：葡萄糖20.0，胰蛋白胨4.0，牛肉膏2.0，酵母粉1.0，NaCl 30.0，K2,HPO41.5，MgCl20.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1，L-Cysteine 0.5，微量元素液(MnSO4·7H2O 0.01，ZnSO4·7H2O 0.05，H3BO30.01，CaCl2·2H2O 0.01，Na2,MoO40.01，CoCl2·6H2O 0.2)10,mL，維生素溶液(L–抗壞血酸Vc 0.025，檸檬酸0.02，吡哆醛0.05，對氨基苯甲酸0.01，生物素0.01，維生素B10.02，核黃素0.025) 10,mL，瓊脂20.0或不加瓊脂；pH 7.2～7.5．

1.3 產(chǎn)氫菌群富集

將3,g(濕質(zhì)量)沉積物接種到裝有100,mL培養(yǎng)基的150,mL血清瓶中．充氮氣15,s后迅速蓋上橡皮塞子，創(chuàng)造厭氧環(huán)境．將血清瓶放入搖床，于37,℃振蕩培養(yǎng)24,h．取1,mL培養(yǎng)物加入新鮮的100,mL培養(yǎng)基中，相同的條件下培養(yǎng)24,h，重復(fù)3次，以達(dá)到富集產(chǎn)氫微生物目的．

1.4 菌株分離與純化

采用對文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行改進(jìn)的三層平板法，步驟如下：LM-H培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后無菌條件下倒平板，待冷卻凝固后用稀釋菌液進(jìn)行涂布；涂布后正置5,min，再倒入一層普通瓊脂；待冷凝后，傾入一層固體石蠟，密閉平板已達(dá)到厭氧條件．待固體石蠟?zāi)虖氐字螅w上平皿，37,℃倒置培養(yǎng)24,h．挑取培養(yǎng)出的單個菌落接種于裝滿LM-H液體培養(yǎng)基的螺口試管中，37,℃正置培養(yǎng)48～72,h．將螺口試管倒置，觀察產(chǎn)氣的高度．選取產(chǎn)氣量較大的試管進(jìn)行編號，進(jìn)行分離、純化及產(chǎn)氫實驗，以獲得產(chǎn)氫的兼性厭氧或嚴(yán)格厭氧微生物．

1.5 形態(tài)學(xué)和生理生化實驗

通過光鏡(Olympus，日本)對菌體的形態(tài)進(jìn)行觀察．生理生化實驗采用Biolog鑒定系統(tǒng)，具體步驟參照Biolog操作手冊(Biolog，美國)．

1.6 16S rDNA序列測定及序列分析

細(xì)菌基因組DNA提取采用酚–氯仿抽提法．根據(jù)Pitcher等[12]的描述稍作改動：取待測微生物菌種接種于LM-H培養(yǎng)基，充氮氣達(dá)到厭氧條件(操作步驟見1.3)，密封后37,℃振蕩培養(yǎng)24,h，5,000,r/min離心10,min收集菌體，用TE緩沖液洗滌2次；菌體重懸于200,μL TE緩沖液，加入溶菌酶(25,μg/mL)混勻，65,℃孵育1,h；加入蛋白酶K(250,μg/mL)和10% SDS 10,μL混勻，55,℃孵育30,min，溶菌產(chǎn)物暫時置于冰上．加入等體積的抽提液(V(酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)＝25∶24∶1)，抽提2次，取上層水相．加入2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇沉淀．沉淀DNA重溶于無菌水中，－20,℃保存?zhèn)溆茫?/p>

以基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增16S rRNA基因，引物按文獻(xiàn)[13]報道，在上海生工生物工程技術(shù)服

務(wù)有限公司合成，序列如下：8,F(5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3′)．反應(yīng)體系采用25,μL體系：10×Ex Taq Buffer 2.5,μL，dNTP Mixture(各2.5,mmol/L)

2,μL，引物(20,μmol/L)各1,μL；模板DNA 1,μL；TaKaRa Ex Taq(5,U/μL)0.125,μL；加滅菌蒸餾水至25,μL．按以下步驟進(jìn)行PCR循環(huán)：94,℃預(yù)變性2,min；94,℃ 30,s，55,℃ 30,s，72,℃ 2,min，35個循環(huán)；72,℃延伸10,min．

取5,μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠(含適量的EB)電泳，用Gene-Genius凝膠成像系統(tǒng)拍照、記錄和分析．?dāng)U增產(chǎn)物用凝膠純化試劑盒純化后進(jìn)行序列測定，測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成．

根據(jù)獲得16S rDNA序列在GenBank中進(jìn)行Blast搜索同源序列，并以ClusterX軟件進(jìn)行多重序列比對．通過MEGA 4.0等軟件，以鄰接法(neighbourjoining)建立系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap置信值估算重復(fù)次數(shù)1,000次[14]．

1.7 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

無菌LM-H培養(yǎng)基裝滿無菌螺口試管(10,mL)，按無菌操作接種菌液5,μL．37,℃靜置培養(yǎng)24,h，混勻后用分光光度計(UV757CRT，中國)測定培養(yǎng)液在600,nm波長處的吸光度．分別對影響生長的起始pH(4～10)、培養(yǎng)溫度(15～42,℃)、NaCl質(zhì)量濃度(0～0.05,g/mL)3個主要條件進(jìn)行單因素實驗，其他條件相同．

1.8 間歇產(chǎn)氣實驗及產(chǎn)氫過程中理化因子的變化

無菌操作接種菌液5,μL到裝有100,mL LM-H培養(yǎng)基的150,mL血清瓶中；充氮氣15,s后迅速蓋上橡皮塞子，以創(chuàng)造厭氧環(huán)境；將血清瓶放入搖床37,℃、130,r/min振蕩培養(yǎng)26,h；采用排水法收集氣體．在間歇產(chǎn)氣實驗中，根據(jù)產(chǎn)氣情況分別在產(chǎn)氣前、產(chǎn)氣中和產(chǎn)氣后取樣，連續(xù)監(jiān)測厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的pH和氧化還原電位(ORP)．pH和氧化還原電位采用DLELTA–320型酸度計進(jìn)行測量；氫氣含量采用GC–2010型氣相色譜儀(中國滕州)測定，氮氣作為載氣，橋流70,mA；柱室、熱導(dǎo)池、汽化室的溫度分別為70、100、80,℃．

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離和鑒定

從紅樹林沉積物中分離獲得1株產(chǎn)氫菌株BH-16，該菌株為兼性厭氧菌株，在有氧條件下生長速度慢．光鏡形態(tài)觀察菌株為短桿狀的革蘭氏陰性菌．采用Biolog鑒定系統(tǒng)分析菌株利用碳源的情況表明：菌株BH-16能夠利用95種碳源中的33種(表1)，在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，沒有找到結(jié)果相似的菌株．

經(jīng)PCR擴(kuò)增和序列測定獲得菌株BH-16的16S rDNA序列，長度為1,418,bp，GenBank登錄號為FJ219587．16S rRNA基因相似性分析發(fā)現(xiàn)菌株BH-16與摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)相似性達(dá)到99%．采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果菌株BH-16與摩氏摩根氏菌歸為一類(圖1)．綜合形態(tài)學(xué)觀察、Biolog鑒定和16S rRNA基因序列分析結(jié)果，菌株BH-16被鑒定為摩氏摩根氏菌，定名為摩氏摩根氏菌M. morganiiBH-16．

許多腸桿菌屬菌株已被報道能夠利用碳水化合物進(jìn)行發(fā)酵制氫，例如：E. cloacaeIIT-BT08、E. asburiaeSNU-1、E. aerogenes HU-101、Pantoea agglomeransBH-18等[2,15–17]．摩氏摩根氏菌隸屬于腸桿菌科摩根氏菌屬，目前尚未見有關(guān)利用此菌進(jìn)行產(chǎn)氫研究的報道．

2.2 生長條件的優(yōu)化

為深入開發(fā)利用產(chǎn)氫菌株BH-16，分析了該菌株在厭氧條件下起始pH、培養(yǎng)溫度和NaCl質(zhì)量濃度對生物量積聚的影響．結(jié)果表明：厭氧條件下起始pH對生物量的積聚影響顯著(圖2)，菌株BH-16的最適起始pH為8.0；菌株在0～0.05,g/mL的NaCl質(zhì)量濃度下都能夠存活，且在0.01～0.03,g/mL條件下生長狀況較好，具有較好的鹽度耐受性(圖3)；菌株在30～42,℃條件下生長狀態(tài)良好，最適生長溫度為37,℃(圖4)．

通常海水的pH和NaCl質(zhì)量濃度分別為7.8～8.2和0.03,g/mL，摩氏摩根氏菌BH-16在此條件下的生長狀態(tài)良好，表明菌株在紅樹林特殊的環(huán)境中已經(jīng)完全適應(yīng)了海水條件，可作為利用海水養(yǎng)殖廢水進(jìn)行廢水處理的候選菌株進(jìn)行深入研究．

2.3 菌株BH-16的產(chǎn)氫能力分析

采用間歇產(chǎn)氣實驗方法分析了在海水培養(yǎng)條件下摩氏摩根氏菌BH-16的發(fā)酵產(chǎn)氫情況，結(jié)果表明在起始葡萄糖質(zhì)量濃度為20,g/L、起始pH為7.2時，菌株BH-16的總產(chǎn)氫量(以單位體積培養(yǎng)液產(chǎn)生氫氣的體積計)和平均產(chǎn)氫速率分別為1,120,mL/L和93.3,mL/(L·h)．產(chǎn)氫現(xiàn)象主要發(fā)生在13～22,h，氫氣的產(chǎn)生始于細(xì)胞生長指數(shù)中期(13,h)，在細(xì)胞生長指數(shù)后期(16,h)產(chǎn)氫速率達(dá)到最高，氫氣主要產(chǎn)生于細(xì)胞生長指數(shù)后期和生長平穩(wěn)早期．

菌株BH-16發(fā)酵產(chǎn)氫過程中生物量的積聚、pH值和氧化還原電位的監(jiān)測如圖5所示．產(chǎn)氫過程中發(fā)酵液的pH從6.0降至4.5，ORP維持在－82～－72,mV．腸桿菌科細(xì)菌發(fā)酵類型多為混合酸發(fā)酵，在利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)氫的過程中，伴隨產(chǎn)生乳酸、乙酸和乙醇等產(chǎn)物[18]．pH降低主要是由于有機(jī)酸乳酸和乙酸的積聚導(dǎo)致的．ORP是表明溶液的氧化和還原性質(zhì)的指標(biāo)，與pH、鹽度、有機(jī)物等因子相關(guān)，常用于廢水處理過程中一個有效的調(diào)控因子[19]．高產(chǎn)氫速率通常發(fā)生在發(fā)酵系統(tǒng)處于低ORP和適合的pH范圍內(nèi)，所以pH和ORP可作為提高產(chǎn)氫速率的調(diào)控指標(biāo)，摩氏摩根氏菌BH-16的高產(chǎn)氫速率發(fā)生在pH為5.2和ORP為－82,mV時．

3 結(jié) 語

從紅樹林沉積物中分離獲得1株產(chǎn)氫的兼性厭氧革蘭氏陰性菌，通過形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)等方法鑒定，確定其為摩氏摩根氏菌BH-16．菌株BH-16的生長條件優(yōu)化結(jié)果表明，該菌株適合在海水條件下生長．間歇產(chǎn)氣實驗表明：摩氏摩根氏菌BH-16具有較高的產(chǎn)氫能力，在起始葡萄糖質(zhì)量濃度為20,g/L、起始pH為7.2的海水培養(yǎng)條件下，菌株的總產(chǎn)氫量和平均產(chǎn)氫速率分別為1,120,mL/L和93.3,mL/(L·h)，可作為利用海水養(yǎng)殖廢水微生物發(fā)酵制氫的候選菌株進(jìn)行深入研究．

［1］ Das D，Veziroglu T N. Hydrogen production by biological processes：A survey of literature[J]. International Journal of Hydrogen Energy，2001，26(1)：13–28.

［2］ Shin J H，Yoon J H，Ahn E K，et al. Fermentative hydrogen production by the newly isolatedEnterobacter asburiaeSNU-1[J]. International Journal of Hydrogen Energy，2007，32(2)：192–199.

［3］ Kalia V C，Jain S R，Kumar A，et al. Fermentation of biowaste to H2byBacillus licheniformis[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，1994，10(2)：224–227.

［4］ Chen W M，Tseng Z J，Lee K S，et al. Fermentative hydrogen production withClostridium butyricumCGS5 isolated from anaerobic sewage sludge[J]. International Journal of Hydrogen Energy，2005，30(10)：1063–1070.

［5］ Lin C Y，Chang C C，Hung C H. Fermentative hydrogen production from starch using natural mixed cultures[J].

International Journal of Hydrogen Energy，2008，33(10)：2445–2453.

［6］ Zhu D L，Wang G C，Qiao H J，et al. Fermentative hydrogen production by the new marinePantoea agglomeransisolated from the mangrove sludge[J]. International Journal of Hydrogen Energy，2008，33(21)：6116–6123.

［7］ Cui Y，Chen B J，Chen J F. Evaluation on self-pollution of marine culture in the Yellow Sea and Bohai Sea[J]. The Journal of Applied Ecology，2005，16(1)：180–185.

［8］ Levin D B，Pitt L，Love M. Biohydrogen production：Prospects and limitations to practical application[J]. International Journal of Hydrogen Energy，2004，29(2)：173–185.

［9］ 任健，閻冰，洪葵. 海南東寨港紅樹林不同植被土壤微生物群落結(jié)構(gòu)比較[J]. 微生物學(xué)報，2012，52(6)：736–743.

［10］ 李永峰，任南琪，陳瑛，等. 發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌分離培養(yǎng)的厭氧實驗操作技術(shù)[J]. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，36(12)：1589–1592.

［11］ Archana A，Sasikala C，Ramana C V，et al. ‘‘Paraffin wax-overlay of pour plate’’，a method for the isolation and enumeration of purple non-sulfur bacteria[J]. Journal of Microbiological Methods，2004，59(3)：423–425.

［12］ Pitcher D G，Saunders N A，Owen R J. Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate [J]. Letters in Applied Microbiology，1989，8(4)：151–156.

［13］ Weisburg W G，Barns S M，Pelletier D A，et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. Journal of Bacteriology，1991，173(2)：697–703.

［14］ Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies：An approach using the bootstrap[J]. Evolution，1985，39(4)：783–791.

［15］ Rachman M A，F(xiàn)urutani Y，Nakashimada Y，et al. Enhanced hydrogen production in altered mixed acid fermentation of glucose byEnterobacter aerogenes[J]. Journal of Fermentation and Bioengineering，1997，83(4)：358–363.

［16］ Yokoi H，Ohkawara T，Hirose J，et al. Characteristics of hydrogen production by aciduricEnterobacter aerogenesstrain HO-39[J]. Journal of Fermentation and Bioengineering，1995，80(6)：571–574.

［17］ Kumar N，Das D. Enhancement of hydrogen production byEnterobacter cloacaeIIT-BT 08[J]. Process Biochemistry，2000，35(9)：589–593.

［18］ 楊生玉，王剛，沈永紅. 微生物生理學(xué)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007：78–80.

［19］ 唐曉，王佳. 海水ORP的影響因素[J]. 裝備環(huán)境工程，2004，1(4)：7–39.

責(zé)任編輯：常濤

Isolation and Characterization of a Morganella morganii Strain with Hydrogen-producing Activities from the Mangrove Sediments

ZHU Daling，YANG Zhenfang，PAN Guanghua
(Tianjin Key Laboratory of Marine Resources and Chemistry，College of Marine Science and Engineering，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

According to the property of gas production，highly hydrogen-producing bacterial strain BH-16 was screened in the culture condition of marine water from the mangrove sediment. The screening and isolation of the strain were realized with the methods of anaerobic enrichment，three-layer plate and the culture in the tube with nut. Strain BH-16 was identified and designated asMorganella morganiiwith light microscopic examination，Biolog test and 16S rDNA sequence analysis. Experiments show that in the anaerobic culture，the optimum initial pH value，NaCl concentration and temperature for cell growth were 8.0，0.01 g/mL and 37,℃，respectively. During fermentation，hydrogen started to evolve when cell growth entered the middle-exponential phase and was mainly produced in the late-exponential phase and the stationary phase. The total hydrogen-production yield(1,120 mL/L)and the overall hydrogen production rate(93.3 mL/(L·h))were obtained at an initial glucose concentration of 20 g/L and an initial pH value of 7.2 in marine culture conditions.

mangrove sediments；Morganella morganii；isolation and identification；hydrogen production by fermentation.

Q935

A

1672-6510(2014)05-0029-06

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.05.007

2013–12–18；

2014–05–04

天津市自然科學(xué)基金資助項目(12JCQNJC04300)；天津市海洋化學(xué)與資源重點實驗室基金資助項目(201203)

朱大玲（1978—），女，山東蓬萊人，副研究員，zhudaling@tust.edu.cn.