加味四物湯對血小板減少性紫癜小鼠影響的實(shí)驗(yàn)研究＊

馮曉燕，顧 鴻，楊長福，施建南，嚴(yán)魯萍

（貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽520002）

特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）是一組因外周血中血小板減少而導(dǎo)致皮膚、黏膜或內(nèi)臟出血的疾病，發(fā)病率很高，臨床約占出血疾病總數(shù)的30%。加味四物湯是貴州省省級名老中醫(yī)嚴(yán)魯萍教授和貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科生醫(yī)在四物湯的基礎(chǔ)上總結(jié)多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，不斷探索而成，該方劑用于治療ITP療效顯著。為研究加味四物湯對ITP的藥效及作用機(jī)制，本科用免疫法建立ITP動物模型，對此方進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)研究，探討該藥的臨床作用及其與免疫因素的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與藥物 KM小鼠74只，體質(zhì)量18～22g雌雄各半，SPF級，由長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動物科技服務(wù)部提供，合格證號：SCXK（湘）2009-0012。戊巴比妥鈉，Sigma公司產(chǎn)品（貨號：P3761）。醋酸潑尼松，市售，浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H133021207，生產(chǎn)批號：1205150。加味四物湯（當(dāng)歸15g、白芍15g、熟地12g、川芎15g、太子參10 g、紫珠草24g、土大黃24g、枸杞10g、黃芪25g、茜草根12g、側(cè)柏葉10g），由貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥劑科提供。將上述藥物按人和動物比例折算用量，用蒸餾水浸泡30min，煎煮2次（30分鐘／次）后，過濾、合并濾液并加熱蒸發(fā)，制成100%水煎濃液（含生藥量為1g／mL），于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?，使用時(shí)常溫靜置40min、充分搖勻。

1.2 儀器與試劑 Muctiskan Go酶標(biāo)儀為Thermo公司生產(chǎn)。Sysmex XT-2000i全自動血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，日本生產(chǎn)；IL-6試劑盒由R＆D公司提供，生產(chǎn)編號：10-27-907。80-2離心沉淀器由上海手術(shù)器廠生產(chǎn)，弗氏完全佐劑（FCA）和弗氏不完全佐劑（FICA）為Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 豚鼠抗小鼠血小板血清（GP-APS）的制備 取KM小鼠，5%戊巴比妥鈉麻醉，眼球取全血，乙二胺四乙酸－二鈉（EDTA-Na2）抗凝，離心分離血小板，調(diào)整血小板數(shù)至1×109／mL；取分離的血小板分別與等量FCA和FICA混合成油包水狀做抗原，取含F(xiàn)CA抗原1mL于0周注射豚鼠足掌、背及腹部皮下至少6位點(diǎn)，取含F(xiàn)ICA抗原1mL分別于1、2、4周注射于豚鼠足掌、背及腹部皮下，每次至少6點(diǎn)，第5周從豚鼠心臟取不抗凝全血，離心分離血清即為GP-APS，分裝貯存于－20℃冰箱。將GP-APS從－20℃冰箱取出，56℃水浴30 min，用等量KM小鼠紅細(xì)胞吸附2次，用生理鹽水稀釋成1∶4濃度待用。

1.3.2 造模與分組 KM小鼠74只，隨機(jī)分成健康組14只、模型生理鹽水組20只、西藥組20只和中藥組20只，每組雌雄各半。除健康組外，各組參照參考文獻(xiàn)［1-3］造模方法并加以改進(jìn)，隔日1次按每20g／100μL腹腔注射1∶4稀釋的GPAPS，造模第8天開始各組均按每20g 0.2mL劑量灌胃，連續(xù)10d；其中，模型生理鹽水組按每20g 0.2mL劑量灌胃給生理鹽水，西藥組以潑尼松按成人60mg／d劑量換算后，按每10g 0.01mg劑量灌胃，中藥組按每20g 0.2mL劑量灌胃。

1.4 指標(biāo)及檢測方法 實(shí)驗(yàn)中觀察小鼠的活動量，飲食飲水量，皮毛光澤度、皮膚淤血出血、體質(zhì)量改變及死亡數(shù)量等基本情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后通過股動脈取血，EDTA-Na2抗凝，采用全自動血細(xì)胞記數(shù)分析儀檢測外周血，離心分離血清，采用雙抗夾心ELISA法，按試劑盒說明方法測定血清IL-6水平。按文獻(xiàn)［4］方法快速剝離股骨，用6號針頭以1mL生理鹽水沖出骨髓，置于EDTA-Na2抗凝管內(nèi)，制成骨髓細(xì)胞懸液，采用全自動血細(xì)胞記數(shù)分析儀檢測骨髓有核細(xì)胞數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，剖胸腹，取胸脾，置于電子天平上稱質(zhì)量；胸腺指數(shù)＝胸腺質(zhì)量／體質(zhì)量，脾臟指數(shù)＝脾臟質(zhì)量／體質(zhì)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示。對于滿足正態(tài)性、方差齊性的多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)動物一般情況 整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，正常組小鼠活動量大，行動敏捷，反應(yīng)靈敏，毛色光澤，體質(zhì)量均增加，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)小鼠的體質(zhì)量平均增加6g左右。模型組小鼠第1次注射GPAPS 1d后，開始逐漸出現(xiàn)瞇眼、毛散亂豎起、活動量減少，鼻部顏色變白，飲食飲水量減少，體質(zhì)量減輕等現(xiàn)象，造模后第8天模型組小鼠逐漸出現(xiàn)了較明顯的皮下紫癜，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)模型組小鼠體質(zhì)量平均減輕7g左右。除健康組沒有小鼠死亡外，西藥組死亡6只，其中雌鼠4只，雄鼠2只；生理鹽水組小鼠死亡8只，其中雌鼠6只，雄鼠2只；中藥組小鼠死亡5只，雌鼠3只，雄鼠2只。

2.2 各組小鼠外周血象的變化 與正常組比較，模型組小鼠除RBC外 WBC、PLT均顯著降低（P＜0.01）。西藥組與中藥組外周血WBC與PLT計(jì)數(shù)均明顯上升（P＜0.05），但中藥組上升更顯著（P＜0.05）。西藥組與中藥組比較，外周血 WBC、RBC、PLT組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.3 各組小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)的變化 與正常組比較，各實(shí)驗(yàn)組小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)量顯著降低（P＜0.01）。與模型生理鹽水組比較，西藥組與中藥組骨髓有核細(xì)胞數(shù)量均增加，其中，西藥組P＜0.05，中藥組P＜0.05，見表2。

表1 各組小鼠外周血象

2.4 各組小鼠血清IL-6水平的變化 各模型組小鼠血清IL-6水平與健康組比較，均明顯下降（P＜0.05），其中，模型生理鹽水組下降最多（P＜0.01）。與生理鹽水組比較，西藥組、中藥組血清IL-6水平均顯著上升（P＞0.05），見表3。

2.5 各組小鼠胸脾指數(shù)變化 各模型組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)與健康組比較均顯著下降（P＜0.05），其中，模型生理鹽水組下降最顯著（P＜0.01）。與模型生理鹽水組比較，西藥組，中藥組脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)均有顯著上升（P＜0.05），見表4。

表2 各組小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)

表3 各組小鼠血清IL-6水平

表4 各組小鼠脾臟、胸腺指數(shù)（±s）

表4 各組小鼠脾臟、胸腺指數(shù)（±s）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與健康組比較；c：P＜0.05，d：P＜0.01，與模型生理鹽水組比較。

組別 n 脾臟指數(shù) 胸腺指數(shù)健康組14 0.003 92±0.000 67 0.004 24±0.001 40模型生理鹽水組 12 0.001 29±0.00047b 0.002 63±0.001 57b西藥組 14 0.002 18±0.000 86da 0.003 81±0.001 42ac中藥組 15 0.001 81±0.000 41db 0.003 99±0.001 49ac

3 討 論

ITP屬于中醫(yī)“血證”、“發(fā)斑”、“肌衄”、“發(fā)斑”、“陰陽毒”“葡萄疫”等范疇，部分嚴(yán)重病例并發(fā)腦出血者可歸屬“中風(fēng)”范疇。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)家將ITP命名為“紫癜病”［5］。目前，臨床上西醫(yī)主要應(yīng)用止血藥、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、雄性激素、脾切除術(shù)和血漿置換、單抗和促細(xì)胞生成因子等進(jìn)行治療［6］，取得了一定的療效。但西藥治療存在不良反應(yīng)大、停藥或減量易復(fù)發(fā)、易反彈等問題。近些年來，中醫(yī)中藥在本病的治療上取得可喜的成績，有了很大的進(jìn)展［7－8］，在一定程度上彌補(bǔ)了西醫(yī)治療的不足，中藥不良反應(yīng)小，改善癥狀明顯、費(fèi)用相對低廉、治病根本等。四物湯是祖國醫(yī)學(xué)中經(jīng)典的補(bǔ)血名方，該方用血中之血藥熟地、白芍配伍血中之氣藥當(dāng)歸、川芎，動靜結(jié)合，剛?cè)嵯酀?jì)，使血虛能補(bǔ)、血瘀能行、血燥能潤、血溢能止，達(dá)到補(bǔ)血不滯血、和血不傷血的目的［9］。加味四物湯是在四物湯原方基礎(chǔ)上，佐以益氣健脾、養(yǎng)陰清熱的中藥而成。有研究表明，該藥方能提升PLT水平、改善粒系病態(tài)造血，對再生障礙性貧血、ITP有較好療效［10－11］。研究表明，黃芪及其合劑對PLT的恢復(fù)有促進(jìn)作用［12］，促進(jìn)骨髓粒系造血，使骨髓體外培養(yǎng)粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞（CFU-GM）集落數(shù)明顯增加［13］。

ITP的病因和發(fā)病機(jī)制到目前仍不很明確，除了認(rèn)為細(xì)菌或病毒感染與其發(fā)病有密切關(guān)系，與肝脾的作用有關(guān)外，不少的研究表明是體液免疫、細(xì)胞免疫及巨核細(xì)胞等的調(diào)控異常和人類細(xì)胞抗原遺傳多態(tài)性等多方面綜合作用的結(jié)果［14－15］。IL-6是一種由免疫活性細(xì)胞分泌的多功能因子，具有免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用，同時(shí)也有顯著的造血調(diào)控作用。它的生物活性主要有促進(jìn)B細(xì)胞增生分化和分泌抗體，活化T細(xì)胞和NK細(xì)胞、刺激肝細(xì)胞分泌急性肝細(xì)胞蛋白，促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖，使垂體分泌促腎上腺皮質(zhì)激素，使形狀細(xì)胞分泌神經(jīng)生長因子樣活性物質(zhì)等。有研究表明細(xì)胞因子IL-6，sIL-2R參與了ITP的發(fā)病過程［16］。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示中藥方劑加味四物湯具有與潑尼松一樣能增加ITP模型小鼠外周血 WBC、PLT水平，促進(jìn)骨髓有核細(xì)胞增殖，使血清IL-6的水平明顯上升的作用。

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