七氟醚抑制人乳腺癌細胞株MCF-7黏附的機制研究＊

李 超，胡嘯玲，曠 昕，劉文捷，曾 希

（1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，湖南衡陽421001；2.南華大學(xué)腫瘤研究所，湖南衡陽421001）

七氟醚于1968年由Regan合成，1986年完成3期臨床試驗，1990年首先由日本的藥監(jiān)部門批準臨床使用。近年來，被許多著名麻醉學(xué)專家譽為吸入麻醉的里程碑式藥物。研究表明，七氟醚可抑制結(jié)腸癌細胞和喉癌細胞的生長，以及肺癌細胞的黏附［1－2］。但七氟醚對人乳腺癌細胞株黏附能力的影響尚未見報道。CD44是一種細胞表面跨膜糖蛋白，屬于黏附分子，其分布十分廣泛，功能主要參與細胞間及細胞與基質(zhì)間的特異性粘連過程，且在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用。目前，CD44作為多種已知腫瘤干細胞的標記物，包括乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、肝細胞癌。CD44參與了這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的過程［3－6］。本研究擬評價七氟醚對人乳腺癌細胞株MCF-7黏附能力、CD44表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人乳腺癌細胞株MCF-7（南華大學(xué)研究所），1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清（Hyclone公司，美國），麻醉氣體監(jiān)測儀（Datex AS／3公司，芬蘭），AestivaR／5型麻醉機（Datex Ohmeda公司，芬蘭）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) MCF-7細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 實驗分組與處理 取對數(shù)生長期的人乳腺癌 MCF-7細胞，采用隨機數(shù)字表法，將其隨機分為4組：不經(jīng)任何處理的Control組、1.7%七氟醚作用的Treat 1組、3.4%七氟醚作用的Treat 2組和5.1%七氟醚作用的Treat 3組。

1.2.3 細胞黏附實驗 分別處理好細胞將100μL細胞懸液加入96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)1h。每孔加入200μL磷酸鹽緩沖液（PBS）振搖5min，洗2遍。棄PBS后加入噻唑藍（MTT），用酶標儀于波長490nm測定吸光度值，并計算黏附率＝（各實驗孔黏附細胞吸光度值／對照孔黏附細胞吸光度值－1）×100%。

1.2.4 CD44mRNA表達的測定 采用qRT-PCR法測定CD44mRNA的表達qRT-PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系為20μL，包括稀釋后的RT產(chǎn)物2μL、2×qRT-PCR緩沖液10μL、5μmol／L miR-155特異性PCR引物0.4μL、5U／μL耐熱DNA聚合酶0.2μL、滅菌雙蒸水7.4μL。反應(yīng)條件：先95℃3min活化Tag酶；然后95℃12s、62℃35s共40個循環(huán)。

表1 4組細胞黏附率的比較（%）

表2 4組細胞CD44mRNA表達比較

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進行分析，組內(nèi)比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組人乳腺癌細胞株MCF-7細胞黏附能力的比較 與處理前比較，Treat 1組、Treat 2組和Treat 3組處理2、4和6 h細胞黏附率降低（P＜0.05）；與處理2h比較，Treat 2組和Treat 3組處理4和6h細胞黏附能力降低（P＜0.05）；與處理4h比較，Treat 2組和Treat 3組處理6h細胞黏附能力降低（P＜0.05）；與Control組比較，Treat 1組、Treat 2組和 Treat 3組處理2、4和6h細胞黏附能力降低（P＜0.05）；與Treat 1組比，Treat 2組和Treat 3組處理2、4和6h細胞黏附能力降低（P＜0.05）；與Treat 2組比，Treat 3組處理2、4和6h細胞黏附能力降低（P＜0.05），見表1。

2.2 4組人乳腺癌細胞株 MCF-7細胞CD44mRNA表達改變 與處理前比較，Treat 1組、Treat 2組和Treat 3組處理2、4和6h細胞CD44的mRNA表達下調(diào)（P＜0.05）；與處理2h比較，Treat 2組和Treat 3組處理4和6h細胞CD44的mRNA表達下調(diào)（P＜0.05）；與處理4h比較，Treat 2組和Treat 3組處理6h細胞CD44的mRNA表達下調(diào)（P＜0.05）；與Control組比較，Treat 1組、Treat 2組和Treat 3組處理2、4和6h細胞CD44的mRNA表達下調(diào)（P＜0.05）；與Treat 1組比，Treat 2組和Treat 3組處理2、4和6h細胞CD44的mRNA表達下調(diào)（P＜0.05）；與 Treat 2組比，Treat 3組處理2、4和6h細胞CD44的mRNA表達下調(diào)（P＜0.05），見表2。

3 討 論

乳腺癌是女性第一大惡性腫瘤，據(jù)美國癌癥協(xié)會（ACS）2011年數(shù)據(jù)統(tǒng)計，2008年世界女性乳腺癌新發(fā)病例1 383 500例，占女性全部惡性腫瘤的23%，死亡458 400例，其中，大約一半的乳腺癌新發(fā)病例和60%的死亡例數(shù)發(fā)生在發(fā)展中國家［7］。在中國，乳腺癌的發(fā)病高峰年齡則出現(xiàn)在45～50歲，這意味著在中國，乳腺癌已經(jīng)嚴重危害了廣大處于事業(yè)和家庭巔峰時期的女性的生命和生活，成為威脅女性健康的“首要殺手”。其對人類健康的嚴重危害已引起了世界衛(wèi)生組織和醫(yī)療界人士的高度重視。

越來越多的研究者從癌細胞中篩選出表達一個或多個表面蛋白標記物（CD44、CD24和 ALDH1）的細胞［8］，這些表面標志有CD44＋／CD24－／Low／ALDH1＋的細胞亞群僅占癌細胞總數(shù)的0.2%～0.8%，其致瘤能力較其他的癌細胞強100倍，100個這類細胞即可在小鼠乳腺中形成與人類乳腺癌相同的腫瘤并具有干細胞特性，因此，具有這類特異性標記的細胞被認為是腫瘤干細胞，即腫瘤“種子”。這些腫瘤干細胞與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、放化療抵抗等密切相關(guān)［9－13］。本研究七氟醚濃度為臨床常用濃度，七氟醚可以安全而有效地用于成人，兒童和老年人的誘導(dǎo)。其誘導(dǎo)迅速快，不良反應(yīng)少，心血管穩(wěn)定性好。與氟烷相比，七氟醚吸入誘導(dǎo)的心血管不良反應(yīng)少；與異丙酚等靜脈麻醉藥相比，誘導(dǎo)時間，心血管穩(wěn)定性和不良反應(yīng)相似，可以作為臨床用藥的另一選擇。此外，七氟醚吸入誘導(dǎo)還可以用于困難插管患者的麻醉處理和對沒有建立靜脈通道的患者。本研究結(jié)果表明，與處理前比較，處理2、4和6h時，不同濃度七氟醚組細胞黏附率依次降低；與對照組比較，經(jīng)1.7%、3.4%和5.1%的七氟醚處理后細胞黏附率依次降低，提示七氟醚可降低人乳腺癌細胞株MCF-7的黏附能力，且呈濃度和時間依賴性。本研究結(jié)果表明，與處理前比較，處理2、4和6h時，不同濃度七氟醚組CD44表達依次下調(diào)；與對照組比較，經(jīng)1.7%、3.4%和5.1%的七氟醚處理后CD44表達依次下調(diào)。細胞黏附分子CD44是一種跨膜糖蛋白，其存在一個高度保守的氨基酸末端，與透明質(zhì)酸結(jié)合結(jié)構(gòu)區(qū)域之間具有氨基酸序列的高度同源性，CD44具有廣泛的組織分布，但目前的研究表明CD44異常表達與腫瘤的黏附及轉(zhuǎn)移相關(guān)，CD44表達越高，腫瘤細胞的黏附能力越強［14］。因此，該研究提示七氟醚降低人乳腺癌細胞株MCF-7的黏附能力可能與其抑制CD44的表達有關(guān)。

綜上所述，七氟醚可降低人乳腺癌MCF-7的黏附能力，且呈濃度和時間依賴性，其機制可能與下調(diào)CD44的表達有關(guān)。

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