肺癌患者外周血AKAP12基因甲基化水平的檢測(cè)及意義

廖和和，張?jiān)其h，吳樹強(qiáng)，李寒春，金 磊，任 宏

（1.陜西省核工業(yè)215醫(yī)院腫瘤外科，陜西咸陽(yáng)712000；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，西安710061；3.西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胸外腫瘤科，西安710077）

A激酶錨定蛋白12（A-kinase anchoring protein 12，AKAP12），在1992年由Gordon等［1］從重癥肌無(wú)力患者的血清中分離得到。AKAP12能夠錨定一些重要信號(hào)蛋白，參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、G蛋白偶聯(lián)受體蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白定向以及細(xì)胞凋亡等過(guò)程［2－3］。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，AKAP12在多種腫瘤中表達(dá)下降或缺失［4－5］，能夠抑制腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移［6－7］。目前，研究發(fā)現(xiàn)，外周血中存在高水平的游離DNA，其中很大一部分來(lái)源于凋亡或者壞死的腫瘤細(xì)胞，因此，檢測(cè)血液標(biāo)本中異常甲基化的DNA，能對(duì)疾病的診斷、預(yù)后及復(fù)發(fā)等提供新思路［8］。本研究采用甲基化特異－高分辨融解曲線法（MS-HRM）檢測(cè)肺癌外周血細(xì)胞游離DNA中AKAP12基因甲基化程度，并結(jié)合患者病理參數(shù)進(jìn)行分析研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009年1月至2011年12月在陜西省核工業(yè)215醫(yī)院和西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院就診的60例肺癌患者，其中男32例，女28例，年齡28～76歲，平均（48.0±12.6）歲；均經(jīng)病理確診，Ⅰ期9例，Ⅱ期19例，Ⅲ期29例，Ⅳ3例；分化好及中等34例，分化差26例。收集患者外周血2～3 mL，分離去血清，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與材料 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit、Hot Star Taq Master Mix（Qiagen 公 司），EZ DNA Methylation-Gold Kit（ZYMO 公司），SYTO 9Green Fuorescent Nucleic Acid Stain（Invitrogen公司），CpGenome Universal Methylated DNA（Millipore公司）。PCR基因擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司），Rotor-Gene 6000熒光定量 PCR 儀（Corbett公司），NanoDrop ND-2000分光光度計(jì)（Thermo公司）。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 分離血清，用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提取細(xì)胞游離DNA，NanoDrop ND-2000（超微量紫外分光光度儀上）檢測(cè)DNA濃度及質(zhì)量，要求光密度（OD）值（A260／A280）約為1.80～2.00，調(diào)整DNA濃度至10ng／μL。1.3.2 甲基化修飾 取上述DNA樣本1ng，使用EZ DNA Methylation Gold Kit，按照說(shuō)明書進(jìn)行甲基化修飾。

1.3.3 引物設(shè)計(jì) 使用軟件MethyPrimer設(shè)計(jì)引物，引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。上游引物序列：5′-GGC GGT TGT TTG GAT TTG GGT T-3′，長(zhǎng)度83bp，下游引物序列：5′-AAC ACG CCC TAC AAC AAC ATC TA-3′），長(zhǎng)度83bp。

1.3.4 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品 以 CpGenome Universal Methylated DNA（Millipore公司）作為100%甲基化的標(biāo)準(zhǔn)品，以100%非甲基化的健康人外周血DNA作為稀釋劑，按不同比例搭配制成100% 、80%、60%、40%、20% 、10%、5%、1% 和 0 甲 基 化 程度的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行下一步的HRM曲線分析后得到標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

1.3.5 MS-HRM測(cè)定 AKAP12啟動(dòng)子區(qū)甲基化擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃5min，1個(gè)循環(huán)；94℃30s，56℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)，72℃5min延伸。使用PCR基因擴(kuò)增儀擴(kuò)增后，使用Rotor-Gene 6000進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析：樣本經(jīng)95℃2min，40℃2min預(yù)處理后，溶解時(shí)溫度由76℃逐漸升高到88℃，每升高0.1℃需記錄數(shù)值。獲得 MS-HRM曲線圖。待測(cè)標(biāo)本需按照標(biāo)準(zhǔn)曲線上來(lái)測(cè)定其甲基化程度。

1.3.6 重復(fù)性檢測(cè) HRM方法檢測(cè)重復(fù)性，采用取100%～0系列濃度的甲基化標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測(cè)2次，觀察HRM曲線的相符程度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，AKAP12甲基化與病理參數(shù)比較，采用χ2檢驗(yàn)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MS-HRM標(biāo)準(zhǔn)曲線和重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 分別將100%～0甲基化標(biāo)準(zhǔn)品基因擴(kuò)增后進(jìn)行HRM曲線檢測(cè)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（圖1）。待測(cè)標(biāo)本的甲基化程度可參照100%～0系列濃度曲線中的相應(yīng)曲線得出。同時(shí)，取100%～0甲基化標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測(cè)2次，得到的HRM曲線形狀基本一致。

圖1 MS-HRM法檢測(cè)AKAP12基因甲基化程度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 MS-HRM檢測(cè)AKAP12基因甲基化結(jié)果 從60例肺癌患者標(biāo)本中檢出34例（56.7%）AKAP12基因甲基化，其中，18例（52.9%）甲基化程度為1%～20%，14例（41.2%）為20%～60%，2例（5.88%）為60%～100%。

2.3 外周血AKAP 12基因甲基化與患者病理參數(shù)相關(guān)性檢測(cè) 外周血中AKAP12基因甲基化水平在不同患者年齡和性別中比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而與肺癌的病理分期和分化程度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 外周血AKAP12基因甲基化與肺癌患者關(guān)系

續(xù)表2 外周血AKAP12基因甲基化與肺癌患者關(guān)系

3 討 論

近年來(lái)，關(guān)于體液中（血液、尿液、唾液及痰液等）細(xì)胞游離DNA的研究得到越來(lái)越多的關(guān)注。目前，認(rèn)為腫瘤患者血液游離DNA主要來(lái)自凋亡細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞等，其中來(lái)源于凋亡細(xì)胞或壞死腫瘤細(xì)胞占較大比例（可高達(dá)93%）［8］。目前，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，體液游離DNA抑癌基因啟動(dòng)子CpG島的異常高甲基化常常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后以及復(fù)發(fā)等密切相關(guān)［9－11］。因此，體液標(biāo)本中游離DNA甲基化水平可以為腫瘤早期篩查、早期診斷、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，并能有助于早期發(fā)現(xiàn)有癌變傾向的細(xì)胞［12］。

AKAP12能夠錨定一些重要信號(hào)蛋白，主要參與蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）復(fù)合物的形成，細(xì)胞骨架的重塑，β2腎上腺素受體復(fù)合物的調(diào)節(jié)及細(xì)胞凋亡等過(guò)程［2－3］。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，AKAP12在多種腫瘤中表達(dá)下降或缺失，可見于黑色素瘤、乳腺癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、食管腺癌、骨肉瘤、前列腺癌、胃癌、血液系統(tǒng)惡性腫瘤等［4－5］，提示 AKAP12可能為一種潛在的抑癌基因。此外，研究還發(fā)現(xiàn)AKAP12具有抑制腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移，阻滯細(xì)胞周期以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡等作用［13－14］。目前，已經(jīng)在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)AKAP12的高甲基化現(xiàn)象，Choi等［15］在胃癌組織和細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)高甲基化（56%）的存在，且與AKAP12表達(dá)缺失相對(duì)應(yīng)。

本研究通過(guò)建立MS-HRM，檢測(cè)50例肺癌患者外周血游離DNA中AKAP12啟動(dòng)子的甲基化狀況，以此探討肺癌患者外周血AKAP12高甲基化與腫瘤發(fā)生的關(guān)系。MS-HRM作為一種先進(jìn)的技術(shù)手段，具有較高的靈敏度、特異性和重復(fù)性，利用此方法可以檢測(cè)出最低1%的基因甲基化，這大大提高了肺癌的檢出率，有利于進(jìn)行高危人群的篩選，早期診斷，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)。本研究結(jié)果顯示，34例（56.7%）肺癌患者標(biāo)本中檢出AKAP12基因甲基化，其中，18例（52.9%）甲基化程度為1%～20%，14例（41.2%）為20%～60%，2例（5.88%）為60%～100%。隨后，筆者研究了肺癌患者外周血AKAP12基因甲基化水平與病理參數(shù)的相關(guān)性，研究表明患者年齡、性別與AKAP12甲基化水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而肺癌的病理分期和分化程度與AKAP12甲基化水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示AKAP12的甲基化與肺癌的進(jìn)展有關(guān)，可以用來(lái)評(píng)估肺癌的分期和惡性程度。

綜上所述，腫瘤中抑癌基因的高甲基化現(xiàn)象普遍存在，單個(gè)基因的甲基化往往不能完整反映腫瘤的基本情況，而進(jìn)一步研究表明每種抑癌基因都存在不同的啟動(dòng)子甲基化模式，因此，對(duì)于AKAP12基因啟動(dòng)子甲基化研究為臨床上多方面、多角度監(jiān)測(cè)腫瘤提供了一個(gè)重要指標(biāo)。

［1］ Cordon T，Grove B，Loftus JC，et al.Molecular cloning and preliminary characterization of a novel cytoplasmic antigen recognized by myasthenia gravis sera［J］.J Clin Invest，1992，90（3）：992-999.

［2］ Diviani D，Scott JD.AKAP signaling complexes at the cytoskeleton［J］.Cell Sci，2001，125（21）：1431-1437.

［3］ Yoon DK，Jeong CH，Jun HO，et al.AKAP12induces apoptotic cell death in human fibrosarcoma cells by regulating CDKI-cyclin D1and caspase-3activity［J］.Cancer Lett，2007，254（1）：111-118.

［4］ Choi YK，Kim JH，Kim WJ，et al.AKAP12regulates human blood-retinal barrier formation by downregulation of hypoxia-inducible factor-l alpha［J］.J Neurosoi，2007，27（16）：4472-4481.

［5］Jin Z，Hamilton JP，Yang J，et al.Hypermethylation of the AKAP12promoter is a biomarker of Barrett′s-associated esophageal neoplastic progression［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2008，17（1）：111-117.

［6］ Xia W，Unger P，Miller L，et al.The Src-suppressed C kinase substrate.SSeCKS is a potential metastasis inhibitor in prostate cancer［J］.Cancer Res，2001，61（14）：5644-5651.

［7］ Gelman IH，Gao L.SSeCKS／Gravin／AKAP12metastasis suppressor inhibits ped080me formation via RhoA-and Cde42-dependent pathways［J］.Mol Cancer Res，2006，4（3）：151-158.

［8］ Ziegler A，Zangemeister-Wittke U，Stahel RA，et al.Circulating DNA：a new diagnostic gold mine ［J］.Cancer Treat Rev，2002，28（5）：255-271.

［9］ Zhong XY，Ladewig A，Sehmid SE，et al.Elevated level of cell-free Plasma DNA is associated with breast cancer Arch［J］.Gynecol Obstet，2007，276（4）：327-331.

［10］Ellinger J，Haan K，Heukamp LC，et al.CPG island hypermethylation in cell free serum DNA identifies patients with localized prostate cancer［J］.Prostate，2008，68（1）：42-49.

［11］Chanm KC，Laim PB，Mokm TS，et al.Quantitative analysis of cireulating methylated DNA as a biomarker for hepatocellular carcinoma［J］.Clin Chem，2008，54（9）：1525-1536.

［12］Esteller M，F(xiàn)raga MF，Paz MF，et al.Herman，Cancer epigenetic and methylation ［J］.Science，2002，297（20）：1807-1808.

［13］Lin X，Nelson P，Gelman IH，et al.SSeCKS，a major protein kinase C substrate with tumor suppressor activity，regulatesG→S progression by controlling the expression and cellular compartmentalization of cyclinD［J］.Mol Cell Biol，2000，20（19）：7259-7272.

［14］Cohen SB，Waha A，Gelman IH，et al.Expression of a down-regulated target，SSeCKS，reverses v-Jun-induced transformation of 10T1／2murine fibroblasts［J］.Oncogene，2001，20（2）：141-146.

［15］Choi MC，Jong HS，Kim TY，et al.AKAP12／Gravin is inactivated by epigenetic mechanism in human gastric carcinoma and shows growth suppressor activity［J］.Oncogene，2004，23（42）：7095-7103.