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    應用Plackett-Burma n設計法篩選大豆花粉萌發(fā)的主要影響因素*

    2014-02-09 03:04:46王昌陵宋書宏孫旭剛王文斌
    大豆科技 2014年3期
    關鍵詞:花粉管碳源花粉

    王昌陵,宋書宏,孫旭剛,王文斌

    (遼寧省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所,沈陽 110161)

    花粉萌發(fā)是高等植物完成有性生殖的重要環(huán)節(jié)[1],花粉萌發(fā)率和花粉管長度是衡量花粉生活力的主要標志。無論在大豆常規(guī)育種中進行親本的選擇配置,還是開展雜交大豆育種試驗,都需要研究大豆花粉的萌發(fā)問題[2]。

    花粉的萌發(fā)是花粉粒吸水后,體積增大,內(nèi)部膨壓增加,使花粉粒內(nèi)壁沿萌發(fā)孔向外突出,形成花粉管的過程[3]?;ǚ哿5拿劝l(fā)啟動是一個較復雜的過程[4]。多種植物花粉的離體萌發(fā)研究表明:花粉離體萌發(fā)的基本條件需要有碳源、礦物質(zhì)元素及生長調(diào)節(jié)劑的參與,只有在培養(yǎng)基中含有足量且合適的營養(yǎng)組分并在適宜的pH和溫度等條件下,花粉才能正常萌發(fā)生長[5]。

    大豆花粉萌發(fā)能力的差異直接影響有性繁殖能力及育種價值的評價。而前人對于大豆花粉離體培養(yǎng)的報道較少,適宜大豆花粉萌發(fā)的培養(yǎng)條件尚需探索。應用Plackett-Burman(PB)設計法篩選了大豆花粉萌發(fā)的主要影響因素[6],旨在對大豆花粉萌發(fā)培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,為大豆雜交育種和親本配置研究提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 大豆材料

    供試大豆材料為遼豆15號,為遼寧省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所選育的北方春大豆品種,2013年種植于遼寧省農(nóng)業(yè)科學院(沈陽市)試驗田內(nèi)。

    1.2 花粉采集方法

    在7月中上旬R2時期(盛花期),于發(fā)育正常的植株上選取花蕾,花蕾的大小應盡量一致,并符合當日可做雜交父本的標準,用鑷子取下后置于干凈離心管內(nèi)放4℃冰箱保存,當日使用。

    1.3 花粉培養(yǎng)方法

    花粉采用液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)[7]。按照不同試驗處理配制液體培養(yǎng)基,用移液器滴一滴在凹形載玻片上。將花蕾的萼片和花瓣剝開,用鑷子夾取花藥在液滴表面快速輕蘸一下,使花粉在培養(yǎng)基上分散開即可。為保持濕度,將載玻片放在鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中,然后放置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)25℃靜置培養(yǎng)3h。培養(yǎng)結束放4℃冰箱保存。

    1.4 花粉發(fā)育指標的測定

    1.4.1 萌發(fā)率的測定 培養(yǎng)后使用萊卡DM 750型顯微鏡進行觀測。當花粉管的長度大于花粉粒的直徑時被計為萌發(fā)。統(tǒng)計萌發(fā)和未萌發(fā)的花粉粒數(shù),根據(jù)公式:萌發(fā)率=萌發(fā)的花粉數(shù)/總的花粉數(shù)×100%計算出萌發(fā)率。每個試驗處理隨機選取3個視野,每個視野所統(tǒng)計的花粉粒不少于100粒。

    1.4.2 花粉管長度的測定 選取已萌發(fā)的花粉用顯微鏡隨機選取3個視野拍照,用Image-Pro Plus圖像分析軟件測量花粉管的長度。每個樣品至少測定50個花粉管,計算平均長度和標準差。

    1.5 單因素試驗

    以30mmol/L的MES為母液,加入10%蔗糖+0.05%Ca2+(CaCl2)+0.02%H3BO4+10%PEG-4000等成分,調(diào)至pH6.0,作為基礎培養(yǎng)基。在探討碳源、Ca2+和植物生長調(diào)節(jié)劑等單因素的影響時,保持基礎培養(yǎng)基的其他組分不變,只改變探討因素的種類和濃度,在相同條件下培養(yǎng)并測定花粉發(fā)育指標。

    1.5.1 碳源的選擇試驗 分別使用蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉和山梨醇作為碳源,濃度均為10%。

    1.5.2 Ca2+源的選擇試驗 分別使用CaCl2和Ca(NO3)2作為Ca2+來源,Ca2+濃度均為0.05%。

    1.5.3 植物生長調(diào)節(jié)劑的選擇試驗 分別在基礎培養(yǎng)基(CK)中加入10mg/L的萘乙酸(NAA)、100mg/L的赤霉素(GA3)、10mg/L的2,4-D和50mg/L的6-BA等植物生長調(diào)節(jié)劑[8]。

    1.6 Plackett-Burman(PB)設計

    根據(jù)單因素試驗確定的培養(yǎng)基組分及前期工作確定的各組分濃度范圍,對影響花粉萌發(fā)的8個因素進行考察。按PB設計安排主要影響因素的篩選試驗,每個因素選取低濃度和高濃度分別作為PB試驗中的水平“-1”、“+1”,響應值為花粉管長度(μm),自變量及其代號編碼和水平見表1[9]。

    表1 Plackett-Burman設計的因素水平及編碼

    1.7 數(shù)據(jù)分析

    采用MINITAB 15數(shù)據(jù)分析軟件和Microsoft Ex?cel軟件進行統(tǒng)計分析。

    2 結果與分析

    2.1 花粉萌發(fā)及花粉管生長的單因素選擇試驗

    2.1.1 碳源的選擇 由圖1可知,在幾種常見碳源中蔗糖是最易被大豆花粉利用的,使用蔗糖的萌發(fā)率(68.96±3.01%)及花粉管長度(295.41±26.51μm)均為最高值;其次為麥芽糖,萌發(fā)率為(60.00±4.22%),花粉管長度為(249.77±15.23μm);葡萄糖和山梨醇等碳源對大豆花粉萌發(fā)的促進作用較小。各碳源對萌發(fā)率和花粉管長度的影響達到極顯著水平(P<0.01)。由此確定選擇蔗糖作為大豆花粉萌發(fā)培養(yǎng)的碳源。

    圖1 碳源對花粉萌發(fā)率及花粉管長度的影響

    2.1.2 Ca2+源的選擇 由圖2可知,使用CaCl2作為Ca2+來源進行培養(yǎng)的萌發(fā)率為(68.96±3.01%),花粉管長度為(295.41±26.51μm),均高于使用Ca(NO3)2作為Ca2+來源的萌發(fā)率(57.98±4.93%)和花粉管長度(219.33±29.61μm),差異達到顯著水平(P<0.05)。由此確定選擇CaCl2作為大豆花粉萌發(fā)培養(yǎng)的Ca2+來源。

    2.1.3 植物生長調(diào)節(jié)劑的選擇 由圖3可以看出,不同的植物生長調(diào)節(jié)劑對大豆花粉萌發(fā)有不同的影響。添加GA3后萌發(fā)率和花粉管長度分別為(75.65±2.74%)和(325.19±13.59μm),均高于對照的萌發(fā)率(68.96±3.01%)和花粉管長度(295.41±26.51μm);添加NAA后萌發(fā)率(72.32±3.74%)比對照略有增加,花粉管長度(277.61±13.81μm)有所降低;添加2,4-D和6-BA均抑制了花粉的萌發(fā)。各種植物生長調(diào)節(jié)劑的影響均達到極顯著水平(P<0.01)。因此在培養(yǎng)基中加入合適濃度的GA3對花粉萌發(fā)有促進作用。

    圖2 Ca2+種類對花粉萌發(fā)率及花粉管長度的影響

    圖3 植物生長調(diào)節(jié)劑對花粉萌發(fā)率及花粉管長度的影響

    2.2 大豆花粉萌發(fā)主要影響因素的確定

    利用MINITAB 15軟件對Plackett-Burman試驗結果(表2)進行分析,得到響應值(花粉管長度)與各因素間的回歸模型:

    式中:Y為花粉管長度的預測值,x1、x2、…x8為自變量編碼值。

    由表3方差分析可知,該模型顯著(P<0.05);模型的調(diào)整確定系數(shù)為R2Adj=0.9745,說明該模型能解釋97.45%響應值的變化,試驗誤差小,因而該模型是合適的。

    表2 Plackett-Burman試驗設計和結果

    表3 Plackett-Burman試驗設計結果方差分析

    分析因素影響的標準化效應(圖4)可知,柱狀圖超出虛線的因素是輸出均值的重要影響因素,可以看出x6、x1、x5為顯著影響因素(表3中P<0.05,在95%概率水平上差異顯著)。說明初始pH、蔗糖、GA3為大豆花粉萌發(fā)的主要影響因素,且由T值可知3個因素均為正效應,增加其水平會促進花粉的萌發(fā)。

    圖4 標準化效應的Pareto圖

    3 討論

    采用單因素試驗確定初始培養(yǎng)基后,再用PB設計法,可以以較少的試驗次數(shù)快速地從眾多相關影響因素中篩選出主要影響因素,為進一步的優(yōu)化試驗指明方向。對大豆花粉萌發(fā)的影響因素進行了研究,確定了培養(yǎng)基中添加蔗糖、CaCl2和GA3可以促進花粉萌發(fā);并篩選出初始pH、蔗糖和GA3為影響花粉萌發(fā)的主要因素,為后續(xù)進行的響應面法優(yōu)化大豆花粉培養(yǎng)條件的試驗提供了依據(jù)[10]。

    [1]趙麗梅,孫寰,黃梅,等.大豆結實率與花粉敗育率之間的關系[J].大豆科學,2004,23(4):249-252.

    [2]孫寰,趙麗梅,王曙明,等.大豆花粉育性分類標準的研究[J].大豆科學,2006,25(4):339-343.

    [3]劉忠松,官春云,陳社員.植物雄性不育機理的研究及應用[M].北京,中國農(nóng)業(yè)出版社,2001.

    [4]孫穎,孫大業(yè).花粉萌發(fā)和花粉管生長發(fā)育的信號轉導[J].植物學報,2001,43(12):1211-1217.

    [5]張紹鈴,陳迪新,康瑯,等.培養(yǎng)基組分及pH值對梨花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響[J].西北植物學報,2005,25(2):225-230.

    [6]Plackeet RL,Wasser S P.The design of optimum multi factori?alexperiments[J].Biometrika,1946,33:305-325.

    [7]金文林,王媛,濮紹京,等.小豆花粉生活力的初步觀察[J].北京農(nóng)學院學報,2003,18(1):1-6.

    [8]薛曉敏,王金政,張安寧,等.植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對桃花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響[J].西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版),2008,36(4):123-127,134.

    [9]Liu C,Liu Y,Liao W,et al.Application of statistically-based experimental designs for the optimization of nisin production fromwhey[J].BiotechnologyLetters,2003,25(11):877-882.

    [10]劉代新,寧喜斌,張繼倫.響應面分析法優(yōu)化副溶血性弧菌生長條件[J].微生物學通報,2008,35(2):306-310.

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