強力接骨膠囊在骨折愈合早中期對BMP表達影響的應(yīng)用基礎(chǔ)研究?

李勇強，曹永登，侯 宇，李 霞，李曉燕，邵雅華，黃 葳，張 麗，師青春，滕義和

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，哈爾濱 150001)

骨挫傷和骨折是骨傷科臨床的常見病、多發(fā)病，如何促進骨折愈合特別是骨質(zhì)疏松患者的骨質(zhì)愈合一直是骨科研究的熱點問題?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)多從基因水平揭示骨折愈合的作用機制，BMPs影響骨折愈合是目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的重要內(nèi)容。強力接骨膠囊具有活血化瘀、補益肝腎、接骨續(xù)筋的功效，在我院已有20多年臨床應(yīng)用，具有副作用少、療效確切、經(jīng)濟簡便的獨特優(yōu)勢，而強力接骨膠囊如何促進骨折愈合的現(xiàn)代研究尚屬空白。筆者擬從分子生物學(xué)水平、以骨折端骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)含量的變化作為主要研究內(nèi)容，對強力接骨膠囊在骨折愈合早中期BMP-2表達的影響進行了探討，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1．1 材料

健康成年新西蘭長耳大白兔90只，雌雄各半，平均兔齡8.4個月，平均體質(zhì)量2.3 kg，由黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院實驗動物中心統(tǒng)一提供；強力接骨膠囊，由本院(省級三甲醫(yī)院)制劑室按國家藥品標準制成口服膠囊制劑；骨折挫傷膠囊，由哈高科佳木斯中藥有限公司生產(chǎn)；1%BMP第一抗體細胞抗BMP單克隆抗體工作溶液，由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院病理科提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 把90只兔隨機分為用藥組、對照組、空白組，分組后用咬骨鉗在橈骨中下1/3處造成0.4 cm骨缺損的骨折模型，用手術(shù)縫合線仔細逐層縫合肌肉、皮下組織、皮膚，并用無菌紗布包扎，不做任何固定。

1.2.2 給藥方法 造模后第2天開始用藥組以0.5 g/(kg·d)標準喂服強力接骨膠囊，對照組以0.3 g/(kg·d)標準喂服骨折挫傷膠囊，空白組喂以白開水。所有實驗動物由專門技術(shù)人員在同一實驗條件下統(tǒng)一喂養(yǎng)和管理。

1.3 標本取材

將3組分別于骨折后用藥1～5周后，從各組中分別隨機抽出6只大白兔，通過耳緣靜脈推入40 ml空氣，利用靜脈空氣栓塞法使其致死。以骨折端為中心取出4.0 cm骨質(zhì)，剔除骨質(zhì)上軟組織及皮膚，保留骨折端上的骨痂，作為實驗用標本。

1.4 組織學(xué)標本制備

實驗標本用4﹪多聚甲醛溶液浸泡固定，再用EDTA進行脫鈣，最后用石蠟包埋并切片。每組切片中隔3張抽1張進行蘇木紫-伊紅(HE)染色并進行組織學(xué)觀察，余下切片進行免疫組化BMP-2染色。

1.5 免疫組化檢測

按照BMP-2免疫組化試劑盒操作方法，對切片進行免疫組化染色。切片染色后，通過與計算機相連的顯微鏡，在顯微鏡放大400倍的情況下將采集到的免疫組化切片圖像存入計算機，并用病理圖像分析系統(tǒng)對其進行分析。然后采用彩色分割方法，分割免疫組化切片圖像中BMP-2陽性產(chǎn)物區(qū)域，從而求出陽性產(chǎn)物平均光密度值和陽性平均積分光密度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察

術(shù)后1周，用藥組在骨折斷端可見大量骨痂生成，骨痂局部可見大量的成纖維細胞、成骨細胞和軟骨細胞，以成纖維細胞為主且分化較成熟，并有少量骨小梁的形成。對照組骨折斷端可見較多成纖維細胞和軟骨細胞，但幼稚細胞多見?？瞻捉M骨折斷端成纖維細胞、軟骨細胞數(shù)量最少且排列稀疏?？瞻住φ战M均未見骨小梁的形成。

術(shù)后2周，用藥組骨折斷端可見較多的骨小梁形成，并有大量的軟骨細胞、成骨細胞，且軟骨細胞大多分化成熟，成骨細胞較大，成纖維細胞數(shù)量較1周前減少。對照組可見大量的成纖維細胞，成骨細胞、軟骨細胞相對較少，且分化較成熟?？瞻捉M成纖維細胞較多，分化較成熟的成骨細胞、軟骨細胞少見?？瞻捉M、對照組可見骨小梁形成但排列稀疏。

術(shù)后3周，用藥組骨小梁進一步增多，排列整齊致密的成骨細胞、骨細胞多見，同時出現(xiàn)少量破骨細胞。對照組成骨細胞數(shù)量增多，成纖維細胞減少；空白組成纖維細胞增多。

術(shù)后4周，用藥組可見大量成熟的骨細胞，并有板層骨、破骨細胞增多。對照組可見較多成骨細胞，并可見少量骨細胞?？瞻捉M成纖維細胞減少，可見成骨細胞，少量骨細胞。

術(shù)后5周，用藥組可見大量骨小梁形成，骨細胞排列致密整齊且大都形成橋接，并可見致密性骨皮質(zhì)。對照組可見大量成骨細胞、較多骨細胞、骨小梁增多，大部分未形成橋接，致密性骨皮質(zhì)少見。空白組成骨細胞增多，未見橋接形成。

2.2 免疫組化染色觀察

術(shù)后1周，用藥組出現(xiàn)大量的纖維性骨痂，骨痂中有較多的BMP-2強陽性染色細胞。對照組可見少量纖維性骨痂，空白組未見明顯的纖維性骨痂。成纖維細胞中對照組BMP-2呈弱陽性表達，空白組未見明顯染色。

術(shù)后2周，用藥組的成骨細胞、細胞外基質(zhì)、間充質(zhì)細胞染色明顯增強，BMP-2陽性表達程度強。對照組成骨細胞、間充質(zhì)細胞呈陽性表達，但染色明顯淺于用藥組。空白組亦可見BMP-2陽性細胞表達，但在數(shù)量、著色方面較用藥組更少。

術(shù)后3周，用藥組的BMP-2的陽性表達減弱，對照組、空白組陽性表達已增強，但三組比較，在表達上用藥組最強，對照組次之，空白組最弱。

術(shù)后4周，用藥組陽性細胞表達的數(shù)量、范圍減少，且成熟的軟骨細胞未見明顯的陽性染色，成熟骨細胞染色淺。對照組、空白組陽性細胞表達增多，范圍加大，但著色較用藥組淺。

術(shù)后5周，用藥組陽性細胞表達數(shù)量、范圍進一步減少，成熟骨細胞未見明顯染色。對照組、空白組陽性細胞表達范圍較前增多，軟骨細胞、骨細胞可有較淺的染色。

所有切片中骨痂局部BMP-2含量最高，成熟骨細胞未見明顯的陽性染色?？v向比較，3組術(shù)后陽性表達細胞BMP-2呈“少→多→少”的含量變化，但用藥組染色高峰出現(xiàn)在術(shù)后2周，對照組、空白組染色高峰相對延后，空白組出現(xiàn)最晚。橫向比較，用藥組陽性染色最強，對照組次之，空白組最弱，術(shù)后第1、2周最為明顯。陽性產(chǎn)物平均光密度值和陽性產(chǎn)物平均積分光密度見表1、2。

表1 不同觀察時間骨痂中BMP-2表達光密度均值

注：用藥組與空白組、對照組比較：*P<0.05

表2 不同觀察時間骨痂中BMP-2表達平均積分光密度

注：用藥組與空白組、對照組比較：*P<0.05

3 討論

骨折的愈合是機體損傷后復(fù)雜的組織學(xué)和生物化學(xué)變化過程，需要許多不同的細胞、生長因子參與修復(fù)，其中BMP-2在骨折愈合過程中起重要作用。其通過調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)骨組織，使組織中未分化的間充質(zhì)細胞遷徙、增殖、分化，從而調(diào)節(jié)及誘導(dǎo)成骨細胞、成軟骨細胞的生長，促進骨、軟骨組織形態(tài)形成，分化成為骨細胞、軟骨細胞。侯曉峰等[1]在鹿茸對實驗型骨折愈合中BMP-2表達影響的研究中，發(fā)現(xiàn)BMP能刺激間充質(zhì)細胞的分化，對干性成骨細胞及誘導(dǎo)性成骨母細胞，BMP能刺激其分化成為軟骨細胞及骨細胞，從而形成軟骨及骨組織。畢鍇、溫建民等[2]在中醫(yī)骨折三期治療對家兔骨折愈合中VEGF與BMP-2表達影響的實驗研究中，通過對家兔骨折愈合過程中BMP-2的免疫組化檢查的圖像分析，發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在治療骨折中能顯著促進骨折愈合中BMP-2的表達。周成洪等[3]在探究接骨3號方對

兔撓骨骨折術(shù)后BMP-2表達影響的研究中發(fā)現(xiàn)，接骨3號方在骨折愈合過程中對BMP-2的持續(xù)表達有明顯的促進作用。BMP-2有很強的促進成骨細胞分化和誘導(dǎo)體外成骨的能力，且已在體內(nèi)和體外的實驗中得到證實[4]。吳劍靜等[5]在仙鹿健骨湯含藥血清對成骨細胞礦化結(jié)節(jié)及BMP-2表達影響的實驗研究發(fā)現(xiàn)，仙鹿健骨湯含藥血清不僅能促進體外培養(yǎng)的新生SD大鼠成骨細胞礦化功能，促進礦化結(jié)節(jié)的形成，還能提高新生SD大鼠成骨細胞中BMP-2的表達水平，增加骨細胞的形成。多數(shù)學(xué)者認為，中藥可以促進骨折部位骨基質(zhì)鈣鹽沉積，提高骨痂質(zhì)量，促進生長激素分泌，可以提高BMP的含量，促進成骨細胞分泌TGF-β，對IGF-1的產(chǎn)生有促進作用[6～8]。

在本次實驗中，術(shù)后1周屬于纖維骨痂階段，成纖維細胞增生活躍。用藥組在術(shù)后1周纖維骨痂大量增生，多于對照組，遠多于空白組，局部骨痂BMP-2的陽性表達均強于對照組和空白組。術(shù)后2～3周，骨折的愈合逐漸由纖維骨痂階段進入軟骨成骨階段。此時間充質(zhì)細胞大量增殖、分化為成骨細胞，成骨細胞功能異?；钴S，BMP-2的含量最多、表達最強。用藥組BMP-2出現(xiàn)高峰在2周，比對照組提前1周出現(xiàn)，同時BMP-2表達的強度也明顯強于對照組和空白組。術(shù)后4～5周，骨折愈合開始轉(zhuǎn)入骨痂的修復(fù)與塑型階段。成骨細胞逐漸減少，骨小梁、板層骨不斷構(gòu)建完成，同時在塑型期破骨細胞不斷增多，而由于成熟骨細胞的不斷增多，陽性細胞數(shù)量的表達不斷減少，著色較淺。從整個實驗過程中可以看出，用藥組的BMP-2陽性表達程度上較對照組、空白組強，數(shù)量較對照組和空白組多，峰值出現(xiàn)的時間較對照組、空白組早。由此可推測，強力接骨膠囊對BMP-2的合成、分泌有促進作用，并影響其分布和改變其表達時間與表達量，從而起到促進骨折愈合的作用。

中醫(yī)藥治療骨折依據(jù)整體觀念把“瘀去、新生、骨和”作為理論，把握骨折各期的不同病理特點，結(jié)合骨折各期治則，運用中醫(yī)藥理論治療各期病人。強力接骨膠囊根據(jù)以上理論研制而成，經(jīng)過多年的臨床實踐探索，方選當歸、紅花、續(xù)斷等23味中藥，意在活血化瘀、接骨續(xù)筋、補益肝腎、調(diào)理氣血。強力接骨膠囊在臨床應(yīng)用上已有20多年的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)，療效頗多。但從未在分子生物學(xué)水平上闡述其機理。本實驗研究采用對BMP-2的表達影響做一定的探索，從分子生物學(xué)水平闡述其對骨折的影響，但骨折愈合是十分復(fù)雜的過程，強力接骨膠囊對BMP-2表達的影響和確切機理還有待進一步研究。

[1] 侯曉峰，李朝旭，劉景生.鹿茸對實驗型骨折愈合中BMP-2表達的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志，2005, 32 (4): 374-376.

[2] 畢鍇，溫建民，孫永生，等.中醫(yī)骨折三期治療對家兔骨折愈合中VEGF與BMP-2表達影響的實驗研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2012,12(18):1344-1347.

[3] 周成洪，龍亨國，詹旭.接骨3號方對兔撓骨骨折術(shù)后BMP-2表達的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2012,30(6):1262-1267.

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[5] 吳劍靜，康孟樂，王靖，等.仙鹿健骨湯含藥血清對成骨細胞礦化結(jié)節(jié)及BMP-2表達影響的實驗研究[J].浙江中醫(yī)雜志，2010，45(2)：103-105.

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[7] 程杰.生骨注射液對體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞BMP-2 mRNA表達的影響[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志，2005, 13(2):203-204.

[8] 侯曉峰,劉景生.中藥促進骨折愈合機理[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志，2003，1(11)：61-63.