健脾祛瘀法對(duì)血脂異常ApoE基因缺失小鼠視網(wǎng)膜RPE黑色素和脂褐素的影響?

王 毅,李 娟,李進(jìn)輝，李羅翔,曾慶華

(成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都 610072)

世界衛(wèi)生組織研究報(bào)告表明，年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration， AMD)致盲約占全球盲人的8.7%，全球約有3000萬(wàn)AMD患者，每年約有50萬(wàn)人因AMD致盲[1]。在我國(guó)，由于人口老齡化進(jìn)程的加劇和飲食結(jié)構(gòu)的變化，其他致盲原因得到或加強(qiáng)了控制，AMD日益成為重要致盲的眼病。AMD發(fā)病機(jī)理尚未明確，國(guó)內(nèi)外研究將AMD相關(guān)危險(xiǎn)因素總結(jié)為以下幾項(xiàng)：RPE代謝功能衰退、年齡因素、遺傳因素、環(huán)境影響、慢性光損傷、營(yíng)養(yǎng)代謝失調(diào)、免疫性疾病、有毒物質(zhì)侵害、心血管系統(tǒng)疾病等[2]。RPE代謝功能減退主要表現(xiàn)為黑色素減少和脂褐素的增多[3]，而研究發(fā)現(xiàn)在AMD眼中,抗RPE細(xì)胞氧化損傷的黑色素?cái)?shù)量不斷下降,且引起氧化損傷的脂褐素不斷增多,使得視網(wǎng)膜RPE的合成分泌功能發(fā)生障礙[4]，因此RPE細(xì)胞代謝功能衰退與AMD互為因果，導(dǎo)致AMD發(fā)生，促進(jìn) AMD發(fā)展?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)氧化損傷引起的AMD沒(méi)有特殊的治療方法，為此我們?cè)谇捌谝褕?bào)道高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠能建立AMD模型[5,6]、健脾祛瘀法方藥可通過(guò)降低血脂發(fā)揮對(duì)該模型AMD治療作用的基礎(chǔ)上[7]，進(jìn)一步觀察健脾祛瘀法對(duì)該模型視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞黑色素和脂褐素的影響，以其更好地闡明健脾祛瘀法方藥對(duì)AMD的治療作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 ApoE-/-小鼠36只，8周齡，體質(zhì)量21～23 g，由北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn))提供。

1.1.2 飼料 普通飼料和高脂飼料均由成都達(dá)碩動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司提供。

1.1.3 藥物 健脾祛瘀中藥配方顆粒(由生蒲黃、白術(shù)、丹參、牡丹皮、郁金等組成)由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司提供(批號(hào)1009049)。

1.1.4 試劑 血脂試劑盒由浙江伊利康生物技術(shù)有限公司提供(產(chǎn)品批號(hào)20080023號(hào))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型和分組 實(shí)驗(yàn)分為5組，60只2月齡ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為普食組、高脂組、高、中、低治療組，每組動(dòng)物12只。前4個(gè)月普食組動(dòng)物給予標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料，其余4組動(dòng)物給予高脂飼料，后1個(gè)月各治療組給予健脾祛瘀中藥配方顆粒，溫開水稀釋后灌胃，給藥量按人與動(dòng)物的體表面積計(jì)算法計(jì)算，高劑量組每只小鼠灌胃0.54 g/ml/100 g/d，中劑量組每只小鼠灌胃0.36 g/ml/100 g/d，低劑量組每只小鼠灌胃0.18 g/ml/100 g/d，普食組和高脂組給予等量生理鹽水灌胃，每天2次，各組動(dòng)物均給予標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料，飼料與水均只有攝取，所有動(dòng)物在裝有清潔過(guò)濾器的籠子中飼養(yǎng)，溫度保持在22～25 ℃，相對(duì)濕度50%，共飼養(yǎng)5月至7月齡。所有實(shí)驗(yàn)根據(jù)赫爾辛基宣言和保護(hù)及運(yùn)用動(dòng)物的指導(dǎo)原則來(lái)進(jìn)行。

1.2.2 血漿總膽固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯檢測(cè) 禁食8 h后，在動(dòng)物宰殺前靜脈注射鎮(zhèn)靜劑戊巴比妥鈉，用肝素化的毛細(xì)血管采集股靜脈血。使用日立7170全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血漿總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)和血漿甘油三酯(TG)。

1.2.3 視網(wǎng)膜RPE形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察和黑色素、脂褐素含量檢測(cè) 摘小鼠左眼，每組共12只眼球，保留約1～2 mm長(zhǎng)視神經(jīng)，用鋒利的刀片在角鞏緣處切一三角形小口，放入FAA(酒精-甲醛-醋酸)液中固定1周，切取含視神經(jīng)的冠狀面眼球壁組織3～5 mm厚，逐級(jí)酒精脫水、石蠟包埋，切片4 um，行銀氨液浸染法(Fontana)染色、醛品紅法(參照Gomori)。銀氨液浸染法(Fontana)染色結(jié)果為：黑色素呈黑色，膠原纖維呈紅色，肌纖維和紅細(xì)胞呈黃色；醛品紅法染色結(jié)果為：脂褐素呈深紫色，肥大細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的顆粒呈紫色，背景呈淡黃色。光鏡下觀察染色切片，首先在低倍視野下(100×)觀察眼球壁各層組織結(jié)構(gòu)，然后在中倍(200×)下觀察RPE形態(tài)結(jié)構(gòu)，選擇視乳頭兩端視網(wǎng)膜各5個(gè)視野，共計(jì)10個(gè)視野，采用Mias 2000圖像分析系統(tǒng)(四川川大智勝軟件股份有限公司)半定量檢測(cè)視網(wǎng)膜RPE胞質(zhì)內(nèi)黑色素和脂褐素面積，計(jì)算每個(gè)視野RPE細(xì)胞內(nèi)黑色素、脂褐素面積，表示黑色素和脂褐素含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血漿TC、LDL、TG比較

表1顯示，與7月齡ApoE-/-高脂組小鼠比較，7月齡ApoE-/-普食組和高、中、低治療組小鼠血漿TC和TG明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～0.001), 7月齡ApoE-/-普食組和高、中治療組小鼠血漿LDL明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，低劑量治療組小鼠血漿LDL降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示健脾祛瘀法方藥可以降低高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠高血脂。

表1 各組小鼠血漿TC、LDL、TG檢測(cè)結(jié)果

注：與7月齡ApoE-/-高脂組比較：※P<0.05，▲P<0.01,△P<0.001

2.2 各組小鼠視網(wǎng)膜RPE形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察和胞漿內(nèi)黑色素、脂褐素含量檢測(cè)結(jié)果

光鏡下可見(jiàn)，7月齡ApoE-/-高脂組小鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞排列紊亂、稀疏和細(xì)胞萎縮，胞漿內(nèi)呈黑色的黑色素分布稀疏，量少，呈深紫色的脂褐素分布密集、重疊，量多；7月齡ApoE-/-普食組小鼠視網(wǎng)膜RPE排列較紊亂、稀疏，細(xì)胞萎縮程度減輕，胞漿內(nèi)黑色素較密集，量較多，脂褐素分布較密集，量較多；7月齡高、中、低治療組小鼠視網(wǎng)膜RPE排列較整齊，未見(jiàn)明顯細(xì)胞稀疏、萎縮，胞漿內(nèi)黑色素分布密集，量多，脂褐素分布較稀疏，量減少。

表2顯示，7月齡高、中、低治療組小鼠RPE胞漿黑色素含量及黑色素/脂褐素比值均比7月齡ApoE-/-高脂組小鼠增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，7月齡高、中、低治療組小鼠RPE胞漿脂褐素含量比7月齡ApoE-/-高脂組小鼠減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。7月齡ApoE-/-高脂組小鼠視網(wǎng)膜RPE胞漿黑色素含量、黑色素/脂褐素比值均比7月齡ApoE-/-普食組小鼠減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～0.01)，7月齡ApoE-/-高脂組小鼠視網(wǎng)膜RPE胞漿脂褐素含量比7月齡ApoE-/-普食組小鼠增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1～圖6)。

多元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，小鼠RPE細(xì)胞內(nèi)黑色素含量與TC、LDL、TG呈線性負(fù)相關(guān)(TC、γ=-0.606，P=0.000；LDL、γ=-0.372，P=0.043;TG、γ=-0.496,p=0.005)。回歸方程：黑色素積分光密度=1837732.32-63225.96×膽固醇，小鼠RPE細(xì)胞內(nèi)脂褐素含量與TC、TG呈線性正相關(guān)(TC、γ=0.918，P=0.000；TG、γ=0.734，P=0.001)；回歸方程：脂褐素積分光密度=418363.52+139394.42×膽固醇，小鼠RPE細(xì)胞內(nèi)黑色素/脂褐素比值與TC、TG呈線性負(fù)相關(guān)(TC、γ=-0.904，P=0.000；TG、γ=-0.675，P=0.002)；回歸方程：黑色素/脂褐素=2.057-0.127×膽固醇。

表2 各組小鼠視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞內(nèi)黑色素、脂褐素積分光密度及黑色素/脂褐素比值

注：與7月齡ApoE-/-高脂組比較：※P<0.05，▲P<0.01,△P<0.001

圖1 普食組，F(xiàn)ontana染色(×400)

圖2 高脂組，F(xiàn)ontana染色(×400)

圖3 高劑量治療組，F(xiàn)ontana染色(×400)

圖4 普食組，醛品紅法染色(×400)

圖5 高脂組，醛品紅法染色(×400)

圖6 高劑量治療組，醛品紅法染色(×400)

3 討論

AMD屬中醫(yī)學(xué)“視瞻昏渺”、“視瞻有色”范疇，本病與肝、脾、腎三臟相關(guān)，為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜之證[8]， 特別認(rèn)為黃斑屬脾所主，脾腎虧虛則氣化乏源，運(yùn)化失權(quán)，水濕痰濁應(yīng)運(yùn)而生，久病而郁，郁久而瘀[9,10]。梁晉普等[11]認(rèn)為，高脂血癥的關(guān)鍵病機(jī)可以概括為痰瘀互結(jié)，而病理過(guò)程的進(jìn)一步發(fā)展，痰瘀互結(jié)沉積血府。本次研究通過(guò)建立血脂異常ApoE-/-小鼠AMD動(dòng)物模型，并按循經(jīng)選藥原則組方，具體由生蒲黃、白術(shù)、丹參、牡丹皮、郁金等藥物組成，共奏健脾祛瘀之功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高、中、低治療組小鼠血漿總膽固醇、血漿甘油三酯比高脂組小鼠顯著降低(P<0.01～0.001)，高、中治療組小鼠血漿低密度脂蛋白比高脂組小鼠顯著降低(P<0.001)，低劑量治療組小鼠血漿低密度脂蛋白比高脂組小鼠降低(P>0.05),表明健脾祛瘀法方藥可通過(guò)祛除痰瘀互結(jié)、阻斷痰瘀互結(jié)降低ApoE-/-小鼠高脂血癥。

血脂異常可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜RPE的形態(tài)損害，從而引起RPE功能代謝損害[12]。RPE功能代謝損傷主要表現(xiàn)為胞漿內(nèi)黑色素減少，脂褐素增多。黑色素被認(rèn)為是視網(wǎng)膜中的1種抗氧化劑,其抗氧化作用機(jī)制主要是吸收可見(jiàn)光光子的能量以及中和活性氧和活性自由基,減少視網(wǎng)膜的光學(xué)和氧化損傷[13]。一旦RPE胞漿黑色素減少將降低視網(wǎng)膜的抗光學(xué)和氧化損傷，導(dǎo)致視網(wǎng)膜光感受器、RPE和Bruch損傷，出現(xiàn)AMD[14]。前期我們已經(jīng)報(bào)道高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠可出現(xiàn)AMD[5,6]，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到高脂組小鼠視網(wǎng)膜RPE不同程度排列紊亂，細(xì)胞萎縮，同時(shí)發(fā)現(xiàn)受損的RPE細(xì)胞胞漿內(nèi)黑色素含量明顯減少，高、中、低治療組可改善視網(wǎng)膜RPE形態(tài)結(jié)構(gòu)，同時(shí)可提高RPE細(xì)胞胞漿內(nèi)黑色素含量，表現(xiàn)為各治療組小鼠視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞內(nèi)黑色素含量比高脂組顯著增多(P<0.001)。揭示健脾祛瘀法方藥可通過(guò)降低血脂，改善RPE形態(tài)結(jié)構(gòu)，保護(hù)RPE細(xì)胞存活，提高視網(wǎng)膜RPE抗氧化劑黑色素含量，減輕RPE氧化損傷和RPE細(xì)胞功能代謝損害，發(fā)揮對(duì)AMD的治療作用。

脂褐素是1種會(huì)產(chǎn)生自由基的物質(zhì)，由RPE細(xì)胞生理性吞噬視網(wǎng)膜感光細(xì)胞部分外節(jié)段后所殘留的部分形成，與RPE的吞噬能力下降有關(guān)，它對(duì)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)起到催化作用，其效應(yīng)是以引起RPE細(xì)胞主要成分的光氧化[15]。AMD的發(fā)病與脂褐素在RPE細(xì)胞的堆積密切相關(guān)，脂褐素被認(rèn)為是細(xì)胞老化和氧化損傷的生物指標(biāo)，蕃茄紅素可以通過(guò)清除上皮細(xì)胞自由基及抗脂質(zhì)過(guò)氧化來(lái)抑制脂褐素的形成，從而阻止AMD的發(fā)生[16]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂組小鼠視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞胞漿內(nèi)脂褐素含量多，高、中、低治療組小鼠視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞脂褐素比高脂組顯著降低(P<0.001)，顯示健脾祛瘀法方藥還可通過(guò)抗RPE細(xì)胞氧化損傷，降低視網(wǎng)膜RPE氧化劑脂褐素生成，保護(hù)RPE結(jié)構(gòu)和功能，達(dá)到治療AMD的作用。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，高脂組小鼠視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞黑色素/脂褐素比值低，高、中、低治療組小鼠視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞黑色素/脂褐素比值比高脂組小鼠明顯增高(P<0.001)，表明健脾祛瘀法方藥不僅能提高抗RPE細(xì)胞氧化損傷的黑色素絕對(duì)量、降低氧化損傷的脂褐素的絕對(duì)量，還可以提高抗氧化與氧化力量對(duì)比中抗氧化的相對(duì)力量，從而增強(qiáng)RPE抗氧化能力，減輕RPE細(xì)胞損傷，改善RPE細(xì)胞功能代謝，發(fā)揮治療AMD作用。

多元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，RPE黑色素含量與血漿TC、LDL、TG呈負(fù)直線相關(guān)，脂褐素含量與血漿TC、TG呈正直線相關(guān)，黑色素/脂褐素比值與血漿TC、TG呈負(fù)相關(guān)，表明血脂異?？芍苯佑绊懞谏?、脂褐素及黑色素/脂褐素比值，血脂異常增高可引起RPE抗氧化作用的黑色素減少，RPE氧化作用的脂褐素增加，同時(shí)導(dǎo)致黑色素/脂褐素比值降低。而健脾祛瘀法方藥可通過(guò)降低血脂，從而提高黑色素含量，降低脂褐素含量，提高黑色素/脂褐素比值，發(fā)揮抗RPE細(xì)胞氧化損傷，達(dá)到治療AMD效果。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，健脾祛瘀法組方中蒲黃的有效成分為黃酮類物質(zhì)，有鈣離子拮抗劑樣作用，且其中的槲皮素具有降脂、降壓等多種藥物作用；蒲黃提取物具有抗自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的作用，并能保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其功能，從而延緩或減輕腦組織再灌注損傷，抑制膽固醇吸收，使膽固醇從腸道排出增加而達(dá)到降血脂的作用[17]；丹參能擴(kuò)張微動(dòng)脈，調(diào)節(jié)微循環(huán)障礙，還能改善血液流變的作用[18]；郁金有降低血脂的作用[19]；牡丹皮有抗血栓和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[20]；白術(shù)有抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，具有免疫調(diào)節(jié)作用[21]。 全方配伍具有降低血脂、改善血液流變學(xué)、抗自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用，對(duì)高脂、自由基、脂質(zhì)過(guò)氧化等引起的AMD具有明顯的療效。

綜上所述，健脾祛瘀法方藥治療AMD的機(jī)制之一，可能是通過(guò)降低血脂異常ApoE-/-小鼠高血脂，從而提高視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞黑色素含量，降低RPE細(xì)胞脂褐素含量及提高黑色素/脂褐素比值，增強(qiáng)RPE細(xì)胞抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力，發(fā)揮治療AMD的作用。

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