尼羅紅熒光法快速檢測培養(yǎng)過程中湛江等鞭金藻的中性脂

王海濤，劉亞男，曹旭鵬，薛 松，王偉良

(1.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所海洋生物工程研究組，大連116023；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049； 3.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237)

尼羅紅熒光法快速檢測培養(yǎng)過程中湛江等鞭金藻的中性脂

王海濤1，2，劉亞男1，曹旭鵬1，薛 松1，王偉良3

(1.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所海洋生物工程研究組，大連116023；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049； 3.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237)

研究一種快速準(zhǔn)確測定微藻中中性脂的方法。湛江等鞭金藻是一種中性脂含量高且具有開發(fā)潛力的能源微藻。以湛江等鞭金藻為實(shí)驗(yàn)對象，首先優(yōu)化尼羅紅染色的條件。當(dāng)二甲基亞砜體積分?jǐn)?shù)為2.0%、尼羅紅質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL、細(xì)胞密度為1.0×106個/mL、激發(fā)波長為480 nm、檢測波長為580 nm時，優(yōu)化的染色時間為10 min。其次測定了背景熒光對檢測的影響。結(jié)果表明，在不同細(xì)胞狀態(tài)下，背景熒光強(qiáng)度大約是微藻內(nèi)熒光強(qiáng)度的20%左右，可以忽略。最后比較了尼羅紅熒光法和重量法。結(jié)果表明，熒光強(qiáng)度與中性脂含量的相關(guān)系數(shù)R2=0.946 8，雖然兩者相關(guān)性并不十分高，但作為一種快速測定微藻中中性脂的方法，尼羅紅熒光法依然是研究微藻培養(yǎng)過程中中性脂含量變化的有效方法。

尼羅紅；中性脂；湛江等鞭金藻；生物柴油

微藻生物柴油是第三代生物柴油，研究微藻中中性脂的積累規(guī)律是降低微藻生物柴油生產(chǎn)成本、實(shí)現(xiàn)微藻生物柴油商業(yè)化的關(guān)鍵[1-3]。在微藻中性脂積累機(jī)制研究中，迫切需要一種能夠準(zhǔn)確快速并且樣品用量少的檢測方法來追蹤中性脂的積累過程。質(zhì)量法、高效液相色譜法和薄層層析-氣相色譜法是測定微藻中中性脂常用的方法[4-6]。這些方法首先通過有機(jī)溶劑將中性脂萃取，然后再通過不同手段定量。為了保證測定的準(zhǔn)確，在萃取過程中要保證將中性脂完全提取，與此同時還要保證提取過程中中性脂不被破壞[7]；在定量過程中，質(zhì)量法需要的樣品量較多(約100 mg)，以保證稱量準(zhǔn)確[8]，色譜法樣品用量少(約5 mg)，但是需要特殊的設(shè)備[9-10](檢測器、色譜柱等)，操作也較為復(fù)雜。因此，這些方法不能用于微藻中性脂的快速檢測[6,11]。

尼羅紅是一種熒光染料，在疏水環(huán)境下可以激發(fā)出紅色熒光。尼羅紅熒光法測定微藻中中性脂含量以其樣品用量少、檢測快速等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于富油微藻的高通量篩選。在富油微藻高通量篩選中，尼羅紅熒光法面臨的主要問題是因部分微藻細(xì)胞壁太厚染料不能進(jìn)入細(xì)胞，從而無法發(fā)揮作用。針對這個問題，人們作了較深入的研究。如采用微波、超聲或二甲基亞砜(DMSO)處理細(xì)胞[6,11-12]。這種針對高通量篩選進(jìn)行的優(yōu)化，必然要考慮不同微藻的特點(diǎn)，特別是具有較厚細(xì)胞壁的微藻，將這種方法應(yīng)用于無細(xì)胞壁的微藻固然可行，但是卻不是這種微藻的最優(yōu)條件(染色劑濃度、DMSO濃度等)，而且一些處理步驟如微波處理等也是不必要的。因此建立針對特定微藻的尼羅紅染色法是必需的。

湛江等鞭金藻(Isochrysiszhangjiangensis)是一種海洋微藻，屬于金藻門，普林藻綱，等鞭藻目，等鞭藻科，在分類學(xué)地位上接近于球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)，無細(xì)胞壁，是一種理想的產(chǎn)油微藻[13]。筆者以湛江等鞭金藻為對象，系統(tǒng)地優(yōu)化尼羅紅染色的條件，包括檢測波長的選擇、細(xì)胞濃度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系、DMSO用量、染色時間和尼羅紅用量，并考察背景熒光對檢測的影響，以期為建立其他無細(xì)胞壁微藻的尼羅紅熒光法提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻株與培養(yǎng)條件

湛江等鞭金藻(Isochrysiszhangjiangensis)，由遼寧省海洋水產(chǎn)研究所提供，保存在中國科學(xué)院淡水藻種庫(編號為FACHB-1750)。海水取自大連周邊海域，砂濾后高壓蒸氣滅菌(110 ℃、15 min)，冷卻至室溫后加入f/2培養(yǎng)基母液(不添加硅酸鹽)，NaNO3為f/2培養(yǎng)基濃度的6倍，其他成分與f/2培養(yǎng)基濃度相同。

1.2 細(xì)胞密度

采用分光光度法測定細(xì)胞密度，測定680 nm處光密度，根據(jù)吸光度與細(xì)胞密度關(guān)系獲得細(xì)胞密度。

1.3 尼羅紅熒光強(qiáng)度測定

熒光強(qiáng)度采用Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)(安捷倫公司)檢測，激發(fā)波長為480 nm，發(fā)射波長為580 nm。海水自熒光直接采用熒光分光光度計(jì)測定；向海水中加入終質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL的尼羅紅和終體積分?jǐn)?shù)為2.0%的DMSO，此時測定的熒光強(qiáng)度減去海水自熒光強(qiáng)度即為海水中尼羅紅熒光強(qiáng)度；用海水將微藻樣品稀釋至細(xì)胞密度1.0×106個/mL左右，測定的熒光強(qiáng)度減去海水自熒光強(qiáng)度為微藻細(xì)胞自身熒光強(qiáng)度；用海水將微藻樣品稀釋至細(xì)胞密度為1.0×106個/mL左右，加入尼羅紅染料使其終質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL，加入DMSO使其終體積分?jǐn)?shù)為2.0%，避光染色10 min，此時測定的熒光強(qiáng)度為總熒光強(qiáng)度，總熒光強(qiáng)度減去微藻細(xì)胞自身熒光和海水自熒光即為微藻內(nèi)尼羅紅熒光強(qiáng)度。

1.4 質(zhì)量法測定中性脂含量

他以為這樣的盛世，會是一千年，一萬年，他讀書學(xué)武，游蕩在街巷里，母親在百花谷迎來送往，打情罵俏，達(dá)官貴人、三教九流在他們倆的小世界之外活色生香地活。三個月后，回望過去，我們不在其中，那也不過是一場做得有些長、又太過熱烈的綺夢罷了，他們真的由夢里醒來了嗎？胡子大叔、秀才哥哥，還有胖嬸，你們掉在這個流言里，不愿醒來，是想搬去萬花谷里繼續(xù)做夢吧！

稱取約100 mg冷凍干燥的藻粉，首先加入3.8 mL的氯仿-甲醇-蒸餾水(體積比為1∶ 2∶ 0.8)，渦旋混合2 min，然后加入1 mL氯仿，渦旋混合0.5 min，最后加入1 mL蒸餾水，渦旋混合0.5 min。4 000 r/min離心5 min，棄去上層，下層在35 ℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸干，剩余物即為脂質(zhì)[4]。將脂質(zhì)用1 mL氯仿溶解，上樣至固相萃取柱(Sep-Pak Vac 6cc 500 mg,Waters)，用10 mL氯仿將中性脂洗脫，除去溶劑，剩余物即為中性脂[7]。

2 結(jié)果與討論

2.1 激發(fā)波長和檢測波長的選擇

當(dāng)環(huán)境極性下降時，尼羅紅最大熒光發(fā)射波長會發(fā)生藍(lán)移[14]。微藻中性脂包括甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯等，其極性依次增強(qiáng)，所以尼羅紅在甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯中的最大熒光發(fā)射波長也不同，分別是580、620和630 nm[11]。不同微藻中這3種脂質(zhì)的比例也不同，所以經(jīng)過尼羅紅染色后，它們的最大發(fā)射波長也不同。針對尼羅紅的這種特性，首先應(yīng)該確定尼羅紅染色后的最大發(fā)射波長。筆者考察湛江等鞭金藻經(jīng)尼羅紅染色后的熒光發(fā)射光譜和尼羅紅本身的熒光發(fā)射光譜，結(jié)果如圖1所示。從圖1可知，經(jīng)尼羅紅染色后的湛江等鞭金藻在500～800 nm內(nèi)有2個特征峰，分別是580和680 nm。其中580 nm處的特征峰是尼羅紅發(fā)出的熒光，680 nm處特征峰為葉綠素發(fā)出的熒光。而尼羅紅自身在這2個波長處沒有明顯特征峰。因此，對于湛江等鞭金藻來講，選擇激發(fā)波長為480 nm，熒光檢測波長為580 nm。這與其他報(bào)道中選取的激發(fā)和檢測波長相同[14]。

圖1 細(xì)胞中和海水中尼羅紅的熒光發(fā)射光譜Fig.1 Emission spectram of nile red in cells and sea water

2.2 細(xì)胞密度與熒光強(qiáng)度關(guān)系

考察細(xì)胞密度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：在細(xì)胞密度在4.0×105～1.5×106個/mL之間時，細(xì)胞密度與熒光強(qiáng)度線性相關(guān)；當(dāng)細(xì)胞密度大于1.5×106個/mL時，熒光強(qiáng)度不再隨細(xì)胞密度的增加而線性增加。這可能是由于細(xì)胞密度太高，出現(xiàn)了遮蔽效應(yīng)，熒光強(qiáng)度與細(xì)胞密度之間的線性關(guān)系被打破，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度不再隨細(xì)胞密度增加而等比例增加。而當(dāng)細(xì)胞密度小于4.0×105個/mL時，熒光強(qiáng)度并不等比例降低，這是由于細(xì)胞密度太低，背景熒光的影響增大所致。檢測熒光時細(xì)胞密度不能過高也不能過低，因此確定最佳的細(xì)胞密度范圍為4.0×105～1.5×106個/mL。這與文獻(xiàn)[6]中報(bào)道的小球藻最佳細(xì)胞濃度相當(dāng)。

圖2 細(xì)胞密度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系Fig.2 Relationship of cell density and relative fluorescence intensity

2.3 二甲基亞砜濃度對熒光強(qiáng)度的影響

DMSO可以協(xié)助尼羅紅進(jìn)入細(xì)胞，通過添加DMSO可以提高微藻染色后熒光強(qiáng)度。如在具有較厚細(xì)胞壁的小球藻和布朗葡萄藻中，添加20%左右DMSO后，熒光強(qiáng)度比未添加DMSO時提高了2～6倍[6,15-16]。在細(xì)胞密度在4.0×105～1.5×106個/mL之間時，考察DMSO濃度對熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)小于2.0%時，熒光強(qiáng)度從0.8% DMSO時的350 a.u.增加到2.0% DMSO時的375 a.u.；當(dāng)DMSO濃度大于2.0%時，繼續(xù)增加DMSO濃度就會發(fā)生熒光淬滅，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降，當(dāng)DMSO濃度達(dá)到8.0%時，熒光強(qiáng)度下降到200 a.u.，只有2.0% DMSO時的53%。對于湛江等鞭金藻來講，熒光強(qiáng)度隨DMSO增加而緩慢升高，但幅度并不明顯，這說明對于無細(xì)胞壁的湛江等鞭金藻來講，由于染料較易穿透，DMSO對熒光強(qiáng)度的促進(jìn)作用有限。在DMSO濃度為2.0%時熒光強(qiáng)度最大，繼續(xù)提高DMSO濃度時熒光強(qiáng)度迅速下降。文獻(xiàn)中報(bào)道的最佳DMSO濃度一般在20%左右[6]，與之相比使湛江等鞭金藻達(dá)到最高熒光強(qiáng)度DMSO濃度很小，考慮到DMSO對染色的促進(jìn)作用，確定2.0%是DMSO的最佳濃度。

圖3 DMSO體積分?jǐn)?shù)對熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effects of DMSO volume ratio on relative fluorescence intensity

在2.0%DMSO體積分?jǐn)?shù)下，考察0.25～2.00 μg/mL尼羅紅質(zhì)量濃度范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度與尼羅紅質(zhì)量濃度的關(guān)系，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：當(dāng)尼羅紅質(zhì)量濃度小于1.00 μg/mL時，熒光強(qiáng)度隨染色劑濃度增加而增強(qiáng)；當(dāng)尼羅紅質(zhì)量濃度達(dá)到1.00 μg/mL時，繼續(xù)增加尼羅紅質(zhì)量濃度，熒光強(qiáng)度不再增加，因此最佳尼羅紅質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL。

圖4 尼羅紅質(zhì)量濃度對熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effects of nile red concentration on relative fluorescence intensity

2.5 染色時間

在2.0%DMSO、1.00 μg/mL尼羅紅濃度下，考察染色時間與熒光強(qiáng)度的關(guān)系，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知：雖然5 min時熒光強(qiáng)度最高，達(dá)到370 a.u.，但是在10 min后熒光強(qiáng)度又略有下降；染色10 min后，熒光強(qiáng)度穩(wěn)定在360 a.u.附近，不再隨染色時間的延長而增加，因此選擇10 min作為染色時間。這與文獻(xiàn)[6]中的最佳染色時間相同。

圖5 染色時間對熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effects of staining time on relative fluorescence intensity

2.6 背景熒光的干擾

在使用熒光分光光度計(jì)定量中性脂時，應(yīng)該考慮到與尼羅紅濃度相關(guān)的背景熒光對測定的干擾。在某些情況下需要進(jìn)行樣品預(yù)處理，如通過離心或者過濾的方法去除背景熒光[17]。熒光分光光度計(jì)測得熒光包括4部分，分別是微藻細(xì)胞自身熒光、溶液中尼羅紅熒光、溶液自身熒光和微藻內(nèi)尼羅紅熒光。微藻內(nèi)尼羅紅熒光與細(xì)胞中性脂含量相關(guān)，其他熒光屬于背景熒光。不同培養(yǎng)時期細(xì)胞的狀態(tài)不同，在適應(yīng)期和對數(shù)生長期，細(xì)胞內(nèi)中性脂含量較少，背景熒光可能會干擾結(jié)果；而在穩(wěn)定期，細(xì)胞內(nèi)中性脂含量較高，背景熒光的干擾相對較小。測定了適應(yīng)期、對數(shù)生長期和穩(wěn)定期的背景熒光，結(jié)果如表1所示。由表1可知：與細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度相比，背景熒光強(qiáng)度較小，最大只有微藻中尼羅紅熒光強(qiáng)度的20%左右，并且強(qiáng)度基本穩(wěn)定，不隨細(xì)胞狀態(tài)變化而變化，因此對于湛江等鞭金藻來講，可以忽略背景熒光對測定的影響。

表1 不同培養(yǎng)階段背景熒光強(qiáng)度

2.7 單位細(xì)胞熒光強(qiáng)度與中性脂含量的關(guān)系

采用批次培養(yǎng)方式，柱狀管式反應(yīng)器培養(yǎng)湛江等鞭金藻，生長曲線如圖6所示。由圖6可知：細(xì)胞在第4天開始進(jìn)入穩(wěn)定期。收集不同培養(yǎng)時間的細(xì)胞樣品，采用優(yōu)化的尼羅紅染色法測定單位細(xì)胞熒光強(qiáng)度，同時采用質(zhì)量法測定此時微藻中中性脂的含量。結(jié)果表明單位細(xì)胞熒光強(qiáng)度和中性脂含量相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)為R2=0.946 8。這表明尼羅紅染色法可以替代重量法測定微藻中中性脂含量。

圖6 湛江等鞭金藻生長曲線Fig.6 Growth curve of I.zhangjiangensis

2.8 與其他微藻尼羅紅染色法的比較

表2總結(jié)了文獻(xiàn)中最優(yōu)尼羅紅染色的條件，從表2中可以看出，與湛江等鞭金藻相比，具有較厚細(xì)胞壁的微藻大都需要較高濃度的DMSO，大約是湛江等鞭金藻的7～15倍。從圖3可以看出， DMSO濃度超過最佳濃度后，熒光強(qiáng)度隨DMSO濃度增加迅速下降，這一現(xiàn)象進(jìn)一步表明有細(xì)胞壁微藻尼羅紅染色條件不適用于無細(xì)胞壁微藻。

不同微藻的最佳尼羅紅濃度不同，但是相差并不懸殊，在0.3～1.5 μg/mL之間。研究背景熒光對測定干擾的報(bào)道不多，筆者系統(tǒng)地考察了不同培養(yǎng)階段背景熒光對檢測的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)背景熒光強(qiáng)度保持恒定，并且與細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度相比較小，約是后者的1/5，因此可以將背景熒光忽略，以簡化檢測流程，提高檢測效率。背景熒光主要來自溶液中的尼羅紅，其強(qiáng)度與尼羅紅濃度相關(guān)，不同微藻使用的尼羅紅濃度相差不大，因此可以推測在檢測其他微藻時，背景熒光也是可以忽略的。

表2 不同微藻尼羅紅染色條件

不同微藻的中性脂成分不同，如布朗葡萄藻的中性脂主要是烴類化合物[20]，因此尼羅紅染色后不同微藻的最大熒光波長也不同。如在小球藻中選擇激發(fā)波長為530 nm、發(fā)射波長為575 nm[6]。因此熒光檢測波長要根據(jù)不同微藻進(jìn)行選擇。

尼羅紅染色法測得的數(shù)據(jù)是相對熒光強(qiáng)度，要最終確定中性脂含量需要熒光強(qiáng)度與中性脂含量的相關(guān)關(guān)系。有研究采用甘油三酯作為標(biāo)準(zhǔn)品獲取熒光強(qiáng)度與中性脂含量的關(guān)系，但是如前所述，尼羅紅在不同中性脂中的最大熒光波長不同，因此采用這種方法會引入系統(tǒng)誤差。本研究中，筆者通過測定不同中性脂含量的湛江等鞭金藻的熒光強(qiáng)度來獲取熒光強(qiáng)度與中性脂含量的關(guān)系，這就消除了因尼羅紅在不同中性脂中的最大熒光波長不同而引入的誤差。這同時說明，不同微藻需要建立各自熒光強(qiáng)度與中性脂含量的關(guān)系。

不同微藻之間染色時間差異不明顯，大都在10 min左右，這說明在DMSO的作用下，細(xì)胞壁不再是尼羅紅進(jìn)入細(xì)胞的障礙，尼羅紅可以通過自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。

對于熒光檢測來講，如果細(xì)胞密度過高，則會引起遮蔽效應(yīng)，此時熒光強(qiáng)度不再隨細(xì)胞密度增加而線性增加。不同微藻的最佳檢測濃度范圍是不同的。對于湛江等鞭金藻，最佳細(xì)胞密度為4.0×105～1.5×106個/mL，這與Chen等[6]報(bào)道的小球藻最佳染色細(xì)胞密度相當(dāng)，但比劉新穎等[15]報(bào)道的布朗葡萄藻細(xì)胞密度范圍窄。這表明不同微藻最佳細(xì)胞密度范圍不同。

3 結(jié) 論

以無細(xì)胞壁的湛江等鞭金藻為研究對象，優(yōu)化了尼羅紅染色法測定中性脂的方法，并與有細(xì)胞壁微藻的尼羅紅染色法作比較。結(jié)果表明：最佳DMSO體積分?jǐn)?shù)為2.0%，最佳尼羅紅質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL，最佳染色時間為10 min，最佳檢測細(xì)胞濃度為1.0×106個/mL，最佳激發(fā)波長為480 nm，檢測波長為580 nm。同時測定了背景熒光對檢測的影響。結(jié)果表明，在不同細(xì)胞狀態(tài)下，背景熒光強(qiáng)度基本恒定，與微藻內(nèi)熒光強(qiáng)度相比較弱，可以忽略。最后比較了尼羅紅染色法和質(zhì)量法，結(jié)果表明熒光強(qiáng)度與中性脂含量相關(guān)系數(shù)達(dá)到R2=0.946 8。與質(zhì)量法相比，尼羅紅染色法檢測時間短，樣品用量少。尼羅紅染色法僅需要10 min即可完成測定，質(zhì)量法則通常需要較長時間；尼羅紅染色法僅需要幾毫升細(xì)胞密度為1.0×106個/mL的樣品，干質(zhì)量大約是0.1 mg，而質(zhì)量法則需要高達(dá)100 mg干藻粉，大約是尼羅紅染色法所需樣品量的1 000倍。尼羅紅染色法是一種快速地檢測微藻中中性脂含量的方法，可以用于快速檢測培養(yǎng)過程中中性脂的變化過程。針對湛江等鞭金藻的尼羅紅熒光法的優(yōu)化過程，也為建立其他無細(xì)胞壁微藻的尼羅紅熒光法提供了參考。

[1] Mata T M,Martins A A,Caetano N S.Microalgae for biodiesel production and other applications:a review[J].Renew Sust Energ Rev,2010,14(1):217-232.

[2] Hu Q,Sommerfeld M,Jarvis E,et al.Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production:perspectives and advances[J].Plant J,2008,54(4):621-639.

[3] Chisti Y.Biodiesel from microalgae[J].Biotechnol Adv,2007,25(3):294-306.

[4] Bligh E,Dyer W J.A rapid method of total lipid extraction and purification[J].Can J Biochem Physiol,1959,37(8):911-917.

[5] Siaut M,Cuiné S,Cagnon C,et al.Oil accumulation in the model green algaChlamydomonasreinhardtii:characterization,variability between common laboratory strains and relationship with starch reserves[J].BMC Biotechnol,2011,11(1):7.doi:10.1186/1472-6750-11-7.

[6] Chen W,Zhang C,Song L,et al.A high throughput nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae[J].J Microbiol Methods,2009,77(1):41-47.

[7] Ryckebosch E,Muylaert K,Foubert I.Optimization of an analytical procedure for extraction of lipids from microalgae[J].J Am Oil Chem Soc,2012,89(2):189-198.

[8] Fidalgo J P,Cid A,Torres E,et al.Effects of nitrogen source and growth phase on proximate biochemical composition,lipid classes and fatty acid profile of the marine microalgaIsochrysisgalbana[J].Aquaculture,1998,166(1/2):105-116.

[9] James G O,Hocart C H,Hillier W,et al.Fatty acid profiling ofChlamydomonasreinhardtiiunder nitrogen deprivation[J].Bioresour Technol,2011,102(3):3343-3351.

[10] Danielewicz M A,Anderson L A,Franz A K.Triacylglycerol profiling of marine microalgae by mass spectrometry[J].J Lipid Res,2011,52(11):2101-2108.

[11] Chen W,Sommerfeld M,Hu Q.Microwave-assisted nile red method for in vivo quantification of neutral lipids in microalgae[J].Bioresour Technol,2011,102(1):135-141.

[12] 張敬鍵,呂雪娟,李愛芬,等.微藻細(xì)胞油脂含量的快速檢測方法[J].中國生物工程雜志,2012(1):64-72.

[13] Feng D,Chen Z,Xue S,et al.Increased lipid production of the marine oleaginous microalgaeIsochrysiszhangjiangensis(chrysophyta) by nitrogen supplement[J].Bioresource Technol,2011,102(12):6710-6716.

[14] Elsey D,Jameson D,Raleigh B,et al.Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids[J].J Microbiol Methods,2007,68(3):639-642.

[15] 劉新穎,汪志平,于金鑫,等.布朗葡萄藻脂質(zhì)含量的熒光光譜檢測方法的改進(jìn)[J].生物工程學(xué)報(bào),2013(3):382-391.

[16] 王海英,符茹,黃寶祥.基于尼羅紅熒光染色的小球藻脂質(zhì)快速檢測方法研究[J].中國油脂,2012(3):78-81.

[17] Cooksey K E,Guckert J B,Williams S A,et al.Fluorometric determination of the neutral lipid content of microalgal cells using nile red[J].J Microbiol Meth,1987,6(6):333-345.

[18] Doan T Y,Obbard J P.Improved nile red staining ofNannochloropsissp[J]. J Appl Phycol,2011,23(5):895-901.

[19] 楊勛,劉平懷,郝宗娣,等.富油微藻Monoraphidiumsp.的分離及其油脂提取工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011(32):19988-19990.

[20] 胡章喜,安民,段舜山,等.不同氮源對布朗葡萄藻生長、總脂和總烴含量的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2009(6):3288-3294.

(責(zé)任編輯 管 珺)

Nile red fluorescence method for rapid measurement of neutral lipids during thecultivation of the marine microalgae Isochrysis zhangjiangensis

WANG Haitao1,2,LIU Yanan1,CAO Xupeng1,XUE Song1,WANG Weiliang3

(1.Marine Bioengineering Group,Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Dalian 116023,China; 2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China; 3.State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

A rapid method for quantifying neutral lipids in microalgae is impending.The marine microalgaIsochrysiszhangjiangensis,an ideal candidate for producing biodiesel,was taken as a model system to establish the nile red florescence method.The optimal staining condition was 2.0% dimethyl sulfoxide (V/V),1.00 μg/mL nile red,1.0×106cell/mL cell density and staining for 10 min.The excitation and emission wavelength was 480 nm and 580 nm,respectively.Background fluorescence at different growth phase was measured and its intensity was only about 20% of the florescence intensity in cell.Compared with the fluorescence intensity in cell,the intensity of background florescence was weak and negligible.A correlation coefficient ofR2=0.946 8 was obtained between the fluorescence intensity of nile red and the neutral lipid content measured by conventional gravimetric method.Although the correlation coefficient was not perfect,nile red method is useful in determining neutral lipid content during microalga cultivation.

nile red; neutral lipid;Isochrysiszhangjiangensis; biodiesel

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.06.015

2013-11-14

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2011CB200903)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2012AA052101)；遼寧省自然科學(xué)基金(2012010263)；中國科學(xué)院“百人計(jì)劃”(A1097)

王海濤(1988—)，男，山東聊城人，博士研究生，研究方向：微藻生物能源；薛 松(聯(lián)系人)，研究員，E-mail:xuesong@dicp.ac.cn

Q93.333

A

1672-3678(2014)06-0078-06