化學抑制劑Woodward′s Reagent K對來源于Erwinia rhapontici NX-5蔗糖異構酶的抑制動力學

王彥媛，李 莎，姚 忠，徐 虹

(南京工業(yè)大學食品與輕工學院，南京211800)

化學抑制劑Woodward′s Reagent K對來源于Erwinia rhapontici NX-5蔗糖異構酶的抑制動力學

王彥媛，李 莎，姚 忠，徐 虹

(南京工業(yè)大學食品與輕工學院，南京211800)

從重組大腸桿菌E.coliBL21 (pET22b-palⅠ)中純化得到來源于ErwiniarhaponticiNX-5的蔗糖異構酶(sucrose isomerase,SIase,EC 5.4.99.11)，以純酶為對象考察其酶活力抑制動力學。結果表明：SIase純比酶活1 512.77 U/mg，動力學常數(shù)Km=260 mmol/L，Vmax=39.41 μmol/(L·s)。以化學抑制劑Woodward′s Reagent K (WRK)對重組蔗糖異構酶進行抑制反應，反應體系中隨著WRK濃度的升高，SIase與底物蔗糖的親和力常數(shù)Km增大，最大反應速度Vmax在一定范圍內保持穩(wěn)定。通過對SIase的抑制動力學分析可得到，WRK對SIase的抑制類型為可逆的競爭性抑制，這可能與WRK與蔗糖的結構類似，與可競爭性的結合SIase的活性中心有關。

蔗糖異構酶;抑制動力學;化學抑制劑Woodward′s Reagent K

蔗糖異構酶(sucrose isomerase，SIase，EC 5.4.99.11)是催化蔗糖異構化，生成異麥芽酮糖(6-O-α-D-吡喃葡糖基-D-果糖，isomaltulose)和海藻酮糖(1-O-α-D-吡喃葡糖基-D-果糖，trehalulose)的關鍵酶(圖1)。作為蔗糖的同分異構體，異麥芽酮糖和海藻酮糖除具有與蔗糖類似的物理性質和口感外,還有低熱量、不致齲齒、不吸濕、耐酸解的特點，被美國 FDA 確定為普遍公認安全食品(GRAS)，是很好的蔗糖替代品[1-4]。

圖1 蔗糖異構酶生物催化蔗糖反應式Fig.1 Transformation from sucrose to isomaltulose by sucrose isomerase

SIase催化蔗糖異構化的產物組成比例隨著產酶微生物來源和催化條件的不同而存在差異，這與SIase的催化機制息息相關。2007 年 Ravaud等[5]獲得了來源于紅色精朊桿菌的SIase晶體結構 (PDB：3GBD)，并初步解析了SIase水解和異構化蔗糖的兩步催化機制，提出SIase的活性中心是由D214、E268和D342組成。目前，國內外對SIase的研究主要涉及酶學性質、基因的克隆表達[6-8]，對SIase的抑制動力學研究未見報道。SIase在酶法合成系列功能性甜味劑方面具有良好的產業(yè)化應用前景，因而對其催化機制及其特性的研究具有重要意義。

化學抑制劑Woodward′s Reagent K(N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3′-sulfonate，WRK )是一種可以與羧基結合的化學修飾劑，可作為酶的化學抑制劑，與活性位點的Glu或Asp結合生成復合物，而發(fā)揮對酶的抑制作用[9-11]，此外WRK與SIase最適底物蔗糖具有相似的主體結構 (圖2)，可作為一種結構類似物酶抑制劑。

本文通過考察WRK對來源于ErwiniarhaponticiNX-5的SIase的抑制動力學，旨在為研究SIase的構效關系提供實驗依據(jù)，并為酶催化特異性機制的認識和酶分子改造奠定基礎。

圖2 WRK和蔗糖的結構Fig.2 Structure of WRK and sucrose

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔗糖異構酶(SIase)由筆者所在實驗室構建的重組菌株E.coliBL21(pET22b-palⅠ) 發(fā)酵產生，并經純化得到；Woodward′s Reagent K(N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3′-sulfonate,WRK)，F(xiàn)luka公司。

Spectrumlab752S型紫外可見分光光度計(上海棱光有限公司)，Universal 320R型臺式離心機(Hettich Zentrifugen)，PowerPac Basic電泳儀(Bio-Rad公司),JY92-II型超聲細胞粉碎機 (寧波新芝生物技術研究所)，Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)(Agilent公司)，KF-5 L型發(fā)酵罐 (高百特發(fā)酵機(上海)有限公司)，HVE-50型全自動滅菌鍋(日本HIRAYAMA公司)，PHSJ-4A型精密pH計(上海雷磁儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體培養(yǎng)及SIase純酶的獲得

重組菌構建[12]、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件參照文獻[13]。

蔗糖異構酶的純化方法參照文獻[12]，其純度經由質量分數(shù)12%的SDS-PAGE電泳檢測[14]。

1.2.2 蛋白濃度的測定

參照Bradford法[15]，以牛血清蛋白為標準蛋白繪制標準曲線。

1.2.3 酶活測定

酶活定義：在30 ℃、pH 6.0的最適反應條件下，每分鐘催化生成1 μmol 異麥芽酮糖所需的酶量定義為一個酶活力單位(U)。

酶催化反應體系與轉化方法：20 μL SIase純酶液用pH 6.0的磷酸緩沖液(PBS)稀釋至100 μL，加入50 g/L的底物蔗糖溶液400 μL,在30 ℃、pH 6.0條件下反應15 min，轉化反應結束后，將轉化液于沸水浴中滅活5 min[16]。

異麥芽酮糖含量的測定方法：采用高效液相色譜法(安捷倫1200型液相色譜系統(tǒng))，色譜條件為色譜分離柱 Rezex RCM-monosaccharide Ca2+column (Phenomenex,USA)、流動相為純水、流速為0.5 mL/min、檢測器為示差折光檢測器(Shodex R101)、進樣量為20 μL、柱溫為80 ℃。

以異麥芽酮糖的標準樣品作色譜分析的標準曲線。

1.2.4 SIase催化蔗糖異構化的反應動力學

以不同濃度蔗糖溶液 (292、585、877、1 169、1 462和1 754 mmol/L)為底物進行酶催化反應，反應體系及轉化條件同1.2.3。測定反應結束時異麥芽酮糖的生成量，計算SIase純酶液催化蔗糖異構化生成異麥芽酮糖的反應速率Vs(Vs=c(異麥芽酮糖)/t)，此催化反應符合單底物的Michaelis-Menten方程。根據(jù)雙倒數(shù)作圖法，以1/Vs對1/c(蔗糖) 作圖，可求得SIase的米氏常數(shù)(Km)和最大反應速率(Vmax)。

1.2.5 不同WRK濃度下SIase的酶活隨處理時間的變化

20 μL SIase純酶液反應體系中加入終濃度分別為2、4和8 mmol/L的WRK，終體積100 μL，處理溫度30 ℃，處理時間分別為5、10、15、20、25、30和40 min，經處理后的酶液以146 mmol/L的蔗糖溶液為底物，反應體系及轉化條件同1.2.3，測定此時異麥芽酮糖的生成量，以無抑制劑存在的條件下測得的酶活為100%，計算相對酶活力。

1.2.6 WRK對SIase的抑制效應分析

測定不同SIase酶量經不同濃度WRK處理后的催化反應速率，處理體系中WRK的終濃度分別為2、4和8 mmol/L，酶濃度依次為3.077、3.846、4.615、6.154和7.692 μmol/L，按照總體積100 μL計算酶液及抑制劑的加入量，30 ℃溫育10 min，以146 mmol/L蔗糖溶液為底物，反應體系及轉化條件同1.2.3，測定反應結束時異麥芽酮糖的生成量，計算抑制劑存在條件下的反應速率Vs，以反應速率Vs對酶濃度c(酶)作圖。

1.2.7 WRK對SIase的抑制類型和抑制常數(shù)分析

將20 μL純化過的SIase純酶液在不同WRK濃度(2、4和8 mmol/L)的體系中溫育10 min(總體積100 μL)，處理后的酶液用于其抑制動力學的測定，SIase經抑制劑處理后降低了酶的活性，降低反應體系中底物濃度(分別為73、146、219、292和365 mmol/L)以便于實驗結果的測定，反應體系及轉化條件同1.2.3，測定反應結束時異麥芽酮糖的含量，計算SIase催化蔗糖異構化反應速率Vs，根據(jù)雙倒數(shù)作圖法，以1/Vs對1/c(蔗糖) 作圖，可求得不同濃度WRK對SIase抑制后的的米氏常數(shù)(Km)和最大反應速率(Vmax)，并計算不同濃度WRK對SIase的抑制常數(shù)(KI)。

2 結果與討論

2.1 蔗糖異構酶SIase的純化

重組E.coliBL21(pET22b-palⅠ) 菌株在最適條件下發(fā)酵所得菌體經洗滌、超聲破碎、離心后取上清液即為粗酶液，過Ni-NTA柱純化，洗脫液經超濾除鹽濃縮后，用質量分數(shù)12%的SDS-PAGE電泳檢測其純度，結果見圖3。由圖3可知，SIase已純化至電泳純，其蛋白相對分子質量在6.5×104左右，所得SIase酶液的蛋白質量濃度為1.3 mg/mL，比酶活為1 512.77 U/mg。

M為標準蛋白;1—粗酶液;2—穿透液;3—洗雜液;4—Ni-NTA活性洗脫液;5—濃縮后酶液圖3 純化后SIase的SDS-PAGE電泳Fig.3 SDS-PAGE analysis of protein purification

2.2 SIase催化蔗糖異構化的反應動力學

分別配置不同濃度的蔗糖(292～1 754 mmol/L)溶液，考察SIase催化不同濃度蔗糖生成異麥芽酮糖的情況，計算蔗糖異構化反應速率Vs，以1/Vs對1/cs作圖，如圖4。計算可得Km和Vmax值分別為260 mmol/L和39.41 μmol/(L·s)。與之前報道的其他來源的SIase相比，E.rhaponticiNX-5來源的SIase與蔗糖的結合能力優(yōu)于E.rhaponticiNCPPB 1578來源的SIase (Km=280 mmol/L)[17]，但明顯低于K.sp.LX-3[18]和P.Rubrum[19]來源的SIase，其Km值分別為54.6和32 mmol/L。

圖4 SIase催化蔗糖異構化反應動力學Fig.4 Kinetics of sucrose isomerization catalyzed by SIase

圖5 WRK處理對SIase酶活力的影響Fig.5 Effects of WRK concentration on inhibition of SIase activities

2.3 不同WRK濃度下SIase的酶活隨處理時間的變化

測定不同WRK濃度，不同處理時間時SIase的酶活力，以SIase的酶活力對時間作圖，0 min為未經抑制劑處理的SIase所具有的酶活，結果見圖5。由圖5可知：在所選濃度范圍內，WRK對SIase的催化活力有顯著的抑制作用。在相同處理時間下，隨WRK濃度升高，SIase的活力逐漸下降，對酶活力的抑制作用增強；當WRK濃度為8 mmol/L，處理時間為10 min時，SIase幾乎喪失活力，WRK的抑制作用達到最高。不同濃度的WRK對SIase酶活力的抑制作用在處理10 min后基本穩(wěn)定。因此，在以后的抑制動力學測定實驗中，抑制劑對SIase的處理時間均為10 min。

2.4 WRK對SIase的抑制效應分析

不同WRK終濃度下對不同酶液量的體系進行預處理后，測定反應速率Vs，以反應速率Vs對酶濃度c(酶)作圖，結果見圖6。由圖6可知：加入不同濃度WRK后,SIase酶的活力均隨酶液量的增加而增大,且酶活力與酶液量呈明顯的線性關系。隨著WRK濃度的提高,直線的斜率逐漸降低,表明WRK對SIase的抑制作用是可逆的[20]。此抑制作用下導致酶活力下降的原因是抑制劑濃度的增加，而不是減少有效酶量。

圖6 WRK濃度對蔗糖轉化速率與酶液量的影響Fig.6 Effects of WRK concentration on velocity of sucrose isomerization Vs and c(SIase)

2.5 WRK對SIase的抑制類型和抑制常數(shù)分析

經不同濃度的WRK處理后的SIase酶液，測定在不同底物濃度下SIase催化生成異麥芽酮糖的量，計算蔗糖異構化的反應速率Vs，以1/Vs對1/cs作圖，結果見圖7。由圖7可知：不同抑制劑濃度的3條直線相交于Y軸，表明在SIase反應過程中WRK僅影響該酶促反應的米氏常數(shù)，Vmax在一定范圍內保持不變；而米氏常數(shù)隨抑制劑濃度增大而增大。由此可以推斷WRK是 SIase的一種競爭性抑制劑[21-22]。

圖7 WRK對SIase的競爭性抑制動力學Fig.7 Kinetics of SIase competitively inhibited by WRK

當競爭性抑制劑存在時，酶催化反應速率與底物濃度的關系滿足式(1)。

(1)

式中，cI、cs分別為抑制劑和底物濃度。

表1為不同濃度WRK對SIase處理后，求得的米氏常數(shù)Km和最大反應速率Vmax以及由式(1)求得的不同WRK濃度下的抑制常數(shù)KI值。加入競爭性抑制劑后，Km與Vmax均發(fā)生了變化，且Km隨抑制劑濃度的增加而增大，而Vmax在一定范圍內維持穩(wěn)定。KI值隨WRK濃度升高而減小，符合競爭性抑制的特點。推測是由于WRK具有與蔗糖相似的結構，當其與蔗糖同時存在時，WRK具有相對于蔗糖較小的相對分子質量(253.27)，易于進入酶的催化中心區(qū)域，可競爭性的占據(jù)底物結合部位，因此降低了SIase與底物蔗糖結合的能力，但當?shù)孜餄舛茸銐虼髸r能與酶活性位點重新結合發(fā)生催化反應。

3 結論與展望

1)重組蔗糖異構酶經過一步Ni-NTA柱純化，可得到電泳純的SIase，其質量濃度為1.3 mg/mL,比酶活為1 512.77 U/mg。

2)研究得到SIase的動力學常數(shù)Km=260 mmol/L，Vmax=39.41 μmol/(L·s)，對SIase的抑制動力學開展研究，以WRK為化學抑制劑，通過其對SIase的抑制動力學研究，闡明了 WRK是SIase的競爭性抑制劑，初步分析認為這與WRK與該酶最適底物蔗糖的結構類似有關。

3)為進一步研究WRK對SIase的抑制作用，計劃開展Erwiniarhapontici來源SIase的晶體結構及WRK與SIase的共結晶結構解析研究，用以深入認識SIase的催化機制，并從結構角度進一步解析WRK對SIase的作用機制。

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(責任編輯 荀志金)

Inhibition kinetics of sucrose isomerase from Erwinia rhapontici NX-5 by Woodward′s Reagent K

WANG Yanyuan,LI Sha,YAO Zhong,XU Hong

(College of Food Science and Light Industry,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

Sucrose isomerase (SIase,EC5.4.99.11) fromErwiniarhaponticiNX-5 was purified from the extract of recombinantE.coliBL21 (pET22b-palⅠ) culture,and the inhibition kinetics of the pure SIase was studied with chemical inhibitor Woodward′s Reagent K(WRK).Results show that SIase had the high specific activity of 1 512.77 U/mg,as well as the Michaelis-Menten constants ofKm=260 mmol/L andVmax=39.41 μmol/(L·s).Kmincreased as the concentration of inhibitor increased,butVmaxkept stable within limits.The inhibition of SIase by WRK was reversible and competitive,probably caused by the similar structure of WRK and sucrose.

sucrose isomerase;inhibition kinetics;Woodward′s Reagent K

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.06.012

2013-03-26

國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)(2012AA021503)；國家自然科學基金(31371732)；教育部博士點基金(20103221110006)；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃(CXZZ12_0418)

王彥媛(1987—)，女，河北衡水人，碩士研究生，研究方向：生物化工；徐 虹(聯(lián)系人)，教授，E-mail:xuh@njtech.edu.cn

Q5

A

1672-3678(2014)06-0062-05