響應(yīng)面法優(yōu)化α-蒎烯發(fā)酵培養(yǎng)基

任 萌，楊建明，咸 漠

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京210095； 2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青島266109；3.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所生物基材料重點實驗室，青島266101)

響應(yīng)面法優(yōu)化α-蒎烯發(fā)酵培養(yǎng)基

任 萌1,2，楊建明2,3，咸 漠3

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京210095； 2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青島266109；3.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所生物基材料重點實驗室，青島266101)

利用響應(yīng)面法對α-蒎烯發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化。先利用單因素實驗法篩選出MD牛肉粉為最有利于發(fā)酵產(chǎn)α-蒎烯的N源。此后用Plackett-Burman (P-B)實驗方法對相關(guān)影響因素效應(yīng)進行評估，篩選出有顯著效應(yīng)的3個因素：檸檬酸用量、牛肉粉用量以及培養(yǎng)基初始pH。然后用最陡爬坡實驗逼近以上3因素最優(yōu)水平。最后由中心組和實驗設(shè)計法及響應(yīng)曲面分析法確定主要因素的最佳條件。在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下，發(fā)現(xiàn)α-蒎烯產(chǎn)量從1.710 mg/L提升到7.053 mg/L，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量提高了3倍左右。

大腸桿菌；α-蒎烯；優(yōu)化；響應(yīng)面分析

α-蒎烯用途廣泛[1]，是多種名貴香料合成的中間體[2-3]，在空氣中可自動氧化聚合變稠，可被應(yīng)用于抗氧化劑[1]。

當α-蒎烯體積濃度大于0.05%時即可達到對多種昆蟲的毒殺作用，因此可以作為潛在的新型農(nóng)藥[4]。根據(jù)Meylemans等[5]和Harvey等[6]的報道，二聚化后的α-蒎烯能量密度達到0.938 g/cm3,凈燃燒可以達到39.5 MJ/L,幾乎可以與JP-10(C10H16，一種高密度合成烴類液體燃料)相媲美[7]，是一種潛在的高能燃料，α-蒎烯還可以用作醫(yī)藥合成的中間體，用來合成具有生理活性的化學(xué)品，如桃金娘烯醛、蒎酮酸酯等[8-9]。

目前，工業(yè)上生產(chǎn)α-蒎烯的主要原料是松節(jié)油，可根據(jù)2種蒎烯沸點不同，采用蒸餾法進行制備[1,10]。但隨著森林資源的不斷開發(fā)和利用，原料松節(jié)油來源成為限制α-蒎烯工業(yè)化生產(chǎn)的短板。因此，開發(fā)一條新的可持續(xù)發(fā)展的α-蒎烯工業(yè)生產(chǎn)途徑顯得尤為重要，而新興的微生物技術(shù)無疑是非常具有吸引力的方法[11-12]。

響應(yīng)面法作為一種統(tǒng)計學(xué)方法，近年來已被廣泛應(yīng)用于生物領(lǐng)域，特別是發(fā)酵行業(yè)[13-16]。而利用響應(yīng)面法，從培養(yǎng)基角度提高重組大腸桿菌生產(chǎn)α-蒎烯的產(chǎn)量，在國內(nèi)尚未有報道。因此，本文采用重組大腸桿菌YJM28作為實驗菌株，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化培養(yǎng)基，從而提高α-蒎烯的產(chǎn)量，以期為實現(xiàn)生物法生產(chǎn)α-蒎烯，并逐步實現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株

重組大腸桿菌YJM28，中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所生物基化學(xué)品團隊實驗室構(gòu)建及保存。

1.2 培養(yǎng)基

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g；加入蒸餾水定容到1 000 mL，121 ℃滅菌20 min后冷卻使用。用前加入氨芐青霉素和氯霉素，終質(zhì)量濃度分別為100和34 mg/L。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、牛肉粉9、K2HPO4·3H2O 9.8、一水合檸檬酸6.3、檸檬酸鐵銨0.3；MgSO42 mmol/L。用時添加氯霉素和氨芐青霉素，終質(zhì)量濃度分別為100及34 mg/L。

1.3 培養(yǎng)條件

用滅菌牙簽挑取單克隆于3 mL LB培養(yǎng)液，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)過夜后進行活化，再按照1%(體積分數(shù))接種量接種于裝有30 mL LB培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，進行二級種子的培養(yǎng)。按照1%接種量向裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的590 mL厭氧瓶中，加入1 mL二級種子培養(yǎng)液，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至 OD600達到0.6～0.9，加入IPTG誘導(dǎo)并加蓋無菌橡膠膠塞，終濃度為0.5 mmol/L,誘導(dǎo)后培養(yǎng)溫度調(diào)至30 ℃，轉(zhuǎn)速不變，發(fā)酵48 h[11，17-19]。

1.4 α-蒎烯濃度檢測及菌濃測定

發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵搖瓶放入60 ℃烘箱加熱處理30 min，用氣相進樣針抽取1 mL氣體進行氣相色譜檢測，以α-蒎烯標準品作為定量標準。儀器型號： SP-6890氣相色譜儀。色譜柱：HP-INNOWax毛細管色譜柱 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)。檢測器：FID。氣化溫度：200 ℃。柱溫：50 ℃保溫0.5 min，然后4 ℃/min升溫至70 ℃，再以20 ℃/min升溫至250 ℃，保溫5 min。檢測器溫度：200 ℃[11,20]。用分光光度計在600 nm波長測定菌體濃度。

1.5 N源篩選

按照9 g/L的添加量分別添加下列7種N源：阿拉丁牛肉粉、奧博牛肉膏、國藥牛肉膏、MD牛肉粉、雙旋牛肉膏、Solarbio牛肉膏和奧博牛肉粉[21]。

1.6 Plackett-Burman(P-B)實驗設(shè)計

用P-B實驗設(shè)計對涉及實驗的8種因素進行篩選，濃度水平及范圍參考文獻[17,22]并做了適當調(diào)整，具體見表1。

1.7 最陡爬坡實驗

爬坡實驗用于P-B實驗結(jié)果篩選出的關(guān)鍵因素，使關(guān)鍵因素濃度最大限度靠近響應(yīng)值極大區(qū)域，步長及變化方向根據(jù)PB實驗結(jié)果得出[13,15]。

1.8 中心組合實驗設(shè)計(CCD)

響應(yīng)面分析法用于確定P-B實驗篩選出的重要影響因素的最佳濃度和考察因素之間的交互作用，最終提高α-蒎烯產(chǎn)量[13]。實驗采用三因素五水平實驗設(shè)計表，其中包含1個星點α(1.68)，正負水平各為1，中心點重復(fù)6次，組數(shù)為20。其他不顯著組分設(shè)為原始值(見表4)，并以此構(gòu)建模型[21]。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基N源篩選及P-B實驗結(jié)果

N源篩選結(jié)果見圖1，由P-B實驗設(shè)計及其回歸分析結(jié)果見表1和表2。

在N源篩選實驗中選用阿拉丁牛肉粉、MD牛肉粉和雙旋牛肉膏等7種N源，結(jié)果見圖1。由圖1可知：MD牛肉粉作為N源時α-蒎烯產(chǎn)量最高，達到387.45 μg/L，其次是阿拉丁牛肉粉，之后是奧博牛肉膏。在發(fā)酵過程中，以MD牛肉粉和奧博牛肉粉作為N源進行α-蒎烯發(fā)酵時，產(chǎn)量差距不大；在菌體培養(yǎng)階段時，MD牛肉粉實驗組菌體濃度達到誘導(dǎo)所需要求的培養(yǎng)時間為3 h左右，而奧博牛肉膏組則需要5 h左右，增加了發(fā)酵結(jié)束所需時間；后期發(fā)酵階段MD牛肉粉實驗組的菌體生長正常，發(fā)酵結(jié)束后菌體不發(fā)生自溶，而奧博牛肉膏實驗組在30 h時菌體進入衰亡階段，發(fā)生自溶。因此，選取MD牛肉粉作為N源進行下一步實驗。

P-B實驗采用N=12的實驗設(shè)計表，對涉及試驗的8個因素進行考察，每個因素采取高低(-1，+1)2個水平，以發(fā)酵結(jié)束后的α-蒎烯濃度作為響應(yīng)值，實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

1—雙旋牛肉膏; 2—Solarbio牛肉膏; 3—國藥牛肉膏; 4—阿拉丁牛肉粉； 5—奧博牛肉膏； 6—MD牛肉粉； 7—奧博牛肉粉圖1 N源對α-蒎烯產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of nitrogen source on yield of α-pinene

表1 P-B實驗設(shè)計因素水平及效應(yīng)分析

注：表中R2=0.984 6; AdjR2=0.976 2。

表2 P-B實驗設(shè)計及結(jié)果

利用Design-Expert 7.0軟件對表2中的實驗數(shù)據(jù)建立多元一次回歸模型，得回歸方程如下：Y=-662.32-137.62A2+198.19B-60.42C+11.05D-94.64E+281.96F+69.93G-68.08。分析結(jié)果見表1。由表1可知，模型的P值(0.044 6)<0.05，說明模型有4.46%的可能性被實驗中的噪聲影響，該模型結(jié)果可靠性較高。8種因素對響應(yīng)值的影響在α=0.05的水平差距顯著，其中，一水合檸檬酸、pH以及牛肉粉3種因素對響應(yīng)值有重要影響，P值依次為0.037 9、0.035 8和0.029 7，均小于0.05，說明3種條件均可提高α-蒎烯產(chǎn)量，特別是牛肉粉和一水合檸檬酸。牛肉粉作為有機N源，增加用量可促進菌體生長，增加產(chǎn)物合成；另一方面，由于前期菌體生長過盛，造成發(fā)酵液黏度增高，溶氧降低，在發(fā)酵后期會抑制菌體生長，造成菌體提前衰老，導(dǎo)致菌體自溶；作為一種弱有機酸，一水合檸檬酸可調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH，起到緩沖培養(yǎng)基pH的作用，另外，從代謝角度考慮，增加一水合檸檬酸用量，可以加快檸檬酸循環(huán)，從而加快乙酰CoA的消耗速率，造成代謝流向TCA循環(huán)靠攏，導(dǎo)致流向甲羥戊酸(MVA)途徑的乙酰CoA減少，從而降低α-蒎烯的合成速率。因此，可通過抑制TCA的循環(huán)速度，減少代謝流向TCA循環(huán)靠攏，增加流向MVA的代謝流，從而提高α-蒎烯產(chǎn)量。

由表1可知，實驗涉及的因素對響應(yīng)值呈正效應(yīng)的有：檸檬酸鐵銨和K2HPO4·3H2O；對響應(yīng)值呈負效應(yīng)的因素有：葡萄糖、牛肉粉、pH、MgSO4和一水合檸檬酸和甜菜堿。因此，可通過增加呈正效應(yīng)因素的用量來增加產(chǎn)量。

2.2 最陡爬坡實驗

根據(jù)P-B實驗篩選出的重要因素對響應(yīng)值的影響效應(yīng)及其大小，設(shè)計最陡爬坡實驗的變化步長及變化方向，設(shè)計及結(jié)果見表3。由表3可知：3種因素的最優(yōu)條件在實驗3與實驗5之間，因此，將實驗4作為響應(yīng)面分析實驗中心點的實驗條件。

2.3 關(guān)鍵組分濃度的優(yōu)化

在P-B實驗及最陡爬坡實驗基礎(chǔ)上確定了3個重要影響因素及響應(yīng)面分析實驗的中心點，采用中心組合設(shè)計(CCD)對牛肉粉、一水合檸檬酸以及pH這3種對響應(yīng)值有重要影響的因素進行三因素五水平(-α、-1、0、1和α)的響應(yīng)面分析實驗，實驗設(shè)計及結(jié)果見表4和表5。

表3 最陡爬坡實驗設(shè)計及結(jié)果

注：步長為牛肉粉2 g/L，pH 0.1以及一水合檸檬酸0.42 g/L。

表4 因素水平表

實驗中共涉及20個試驗點，包括14個析因點和零點(重復(fù)6次來評價實驗誤差)。用Design-Expert 7.0軟件對表5的實驗數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合并建立回歸方程，得回歸方程如下：Y=4 840.77-1 363.59A-160.90B-254.24C-275.87AB-91.72AC-124.76BC-327.98A2+938.72B2-168.34C2，式中Y為產(chǎn)物α-蒎烯的質(zhì)量濃度(mg/L)。

對回歸方程進行方差分析，分析結(jié)果見表6。由表6可知：3個因素對產(chǎn)物產(chǎn)量的影響大小順序為：牛肉粉、一水合檸檬酸、培養(yǎng)基初始pH。模型的P值(0.000 4)<0.01，說明模型在α=0.01水平上差異極顯著；失擬項P=0.572 9>0.1，說明選擇模型正確；模型的相關(guān)系數(shù)R2(0.909 9)>0.9，表明模型擬合良好。綜上所述，該模型能夠?qū)Ζ?蒎烯發(fā)酵實驗進行可信度較高的預(yù)測和分析。

表5 中心組合設(shè)計及實驗結(jié)果

表6 中心組合實驗結(jié)果的方差分析

注：R2=0.909 9;SS為平方和;DF為自由度;MS為均方;CE為系數(shù)預(yù)測。**表示在99%置信度下顯著；*表示在95%置信度下顯著。

利用軟件Design-Expert 7.0對表5的實驗數(shù)據(jù)進行響應(yīng)曲面擬合，結(jié)果見圖2。由圖2可知：pH和牛肉粉交互作用不顯著，牛肉粉用量和一水合檸檬酸用量、一水合檸檬酸用量與pH之間交互作用顯著。由軟件對模擬出的響應(yīng)曲面進行分析，發(fā)現(xiàn)回歸方程存在穩(wěn)定點(極大值點)。對響應(yīng)曲面立體圖形進行嶺嵴分析(ridge analysis)，得到極大值點所對應(yīng)的各主要因素預(yù)測的實際值分別是：牛肉粉用量、pH和一水合檸檬酸用量，分別為10 g/L、7.2和2.16 g/L，此時的響應(yīng)值最大，發(fā)酵產(chǎn)物α-蒎烯質(zhì)量濃度為7.078 mg/L。

圖2 牛肉粉、C6H8O7·H2O和pH響應(yīng)面分析曲面圖Fig.2 Response surface plot and contour plots for the effects on the yield of α-pinene

2.4 回歸模型驗證

用以上確定的主要因素用量配制發(fā)酵培養(yǎng)基，進行3次平行試驗，得到的產(chǎn)物質(zhì)量濃度平均值是7.053 mg/L，和預(yù)測值7.078 mg/L高度基本一致(相似性達99.6%)，說明響應(yīng)面分析法可靠性較高，與實際情況擬合良好。通過培養(yǎng)基組分的優(yōu)化，YJM28發(fā)酵的α-蒎烯產(chǎn)量從1.710 mg/L提高到7.053 mg/L，約提高了3倍。

3 結(jié) 論

采用響應(yīng)面法對影響菌株YJM28發(fā)酵水平的8個因素進行優(yōu)化，所得結(jié)論如下：

1)經(jīng)過P-B實驗設(shè)計法篩選出3個影響因素，牛肉粉、一水合檸檬酸和培養(yǎng)基初始pH；

2)然后用最陡爬坡實驗法接近3個重要因素的最優(yōu)水平，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)水平將出現(xiàn)在牛肉粉12 g/L，培養(yǎng)基初始pH 7.1，一水合檸檬酸2.52 g/L附近；

3)最后用CCD設(shè)計和響應(yīng)曲面分析法確定重要因素的最佳水平，即：牛肉粉10 g/L，培養(yǎng)基初始pH 7.2，一水合檸檬酸2.16 g/L；

4)經(jīng)過上述方法得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基條件：牛肉粉10 g/L，培養(yǎng)基初始pH 7.2，一水合檸檬酸2.16 g/L，MgSO42 mmol/L，檸檬酸鐵銨0.45 g/L，甜菜堿0.1 g/L，K2HPO4·3H2O 9.8 g/L，優(yōu)化后產(chǎn)物α-蒎烯產(chǎn)量從最初的1.710 mg/L提升到7.053 mg/L，產(chǎn)量增加了3倍左右。

結(jié)果表明，通過優(yōu)化菌株YJM28發(fā)酵培養(yǎng)基，α-蒎烯產(chǎn)量提升明顯，說明響應(yīng)面法優(yōu)化YJM28發(fā)酵培養(yǎng)基方法可行，效果顯著，為后續(xù)的進一步優(yōu)化和放大提供了理論基礎(chǔ)。但是優(yōu)化后的α-蒎烯產(chǎn)量離工業(yè)化要求相差甚遠，后期可能圍繞發(fā)酵條件或者菌株本身開展研究，以進一步提高α-蒎烯產(chǎn)量。

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(責(zé)任編輯 周曉薇)

Medium optimization for α-pinene production with responsesurface analysis

REN Meng1,2,YANG Jianming2，3,XIAN Mo3

(1. School of Life and Sciences,NanJing Agricultural University,Nanjing 210095,China； 2. College of Life and Sciences, Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China; 3. CAS Key Laboratory of Bio-based Material, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology,Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266101,China)

Response surface analysis was used to optimize forα-pinene production. Initially,MD beef extract powder was determined to be the best nitrogen source forα-pinene production,then Plackett-Burman (P-B) experiment was used to evaluate the eight nutritional variables to screen medium component that significantly influence theα-pinene production and their optimal levels. Results showed that beef extract powder,pH and citric acid were significant factors. Then the path of steepest ascent was used to approach the optimal region of the above three factors. In the third step,the concentration of beef extract powder,pH and citric acid was further optimized using central composite designs and response surface analysis. As the result,the concentration of α-pinene increased from 1.710 to 7.053 mg/L. With the optimized medium,the yield ofα-pinene increased about 3-fold.

E.coli;α-pinene;optimization;response surface analysis

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.06.002

2013-10-09

國家自然科學(xué)基金(21376255)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(SS2013AA050703-2)；青島科技發(fā)展計劃(12-1-4-9-(3)-jch)

任 萌(1988—)，男，陜西咸陽人，碩士研究生，研究方向：生物化工；楊建明(聯(lián)系人)，教授，E-mail：yjming888@126.com

Q851

A

1672-3678(2014)06-0006-06