5 種鮮切藕片脹袋微生物的分離與鑒定

李新楠，齊小保，嚴(yán)守雷，李 潔，王洪斌，王清章

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

5 種鮮切藕片脹袋微生物的分離與鑒定

李新楠，齊小保，嚴(yán)守雷，李 潔，王洪斌，王清章*

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

為解決真空包裝鮮切藕片的脹袋問題，本實驗對鮮切藕片脹袋主要微生物的種類進行研究，分離出5 種優(yōu)勢微生物，并利用VITEK 2 Compact全自動快速微生物鑒定智能分析系統(tǒng)進行鑒定。得到2 株細(xì)菌，分別為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、蠟樣芽孢桿菌（Bacilllus cereus Frankland & Frankland）；3 株酵母菌，分別為季也蒙假絲酵母（Candida guilliermondii）、無名假絲酵母（Candida famate）和葡萄牙假絲酵母（Candida iusitaniae）。

脹袋藕片；分離；鑒定；VITEK 2 Compact菌種鑒定系統(tǒng)

蓮藕是我國栽培歷史悠久的水生蔬菜，因其迷人的白色、甜脆的口感和豐富的營養(yǎng)已經(jīng)成為各地最流行的蔬菜之一。近年來，鮮切蓮藕作為一種新型的微創(chuàng)處理蔬菜，以其方便、快捷、低碳、環(huán)保和安全潔凈的特點深受廣大顧客的喜愛[1]。但是，鮮切蓮藕的保質(zhì)期一直是制約產(chǎn)業(yè)化的瓶頸，究其原因，鮮切蓮藕在其加工過程中，細(xì)胞組織受損，易受微生物污染[2]，鮮切蓮藕的高濕度和高營養(yǎng)促進微生物生長繁殖。因此，要想控制鮮切蓮藕的微生物的生長繁殖，就必須探究促使鮮切蓮藕脹袋的微生物菌群，也進一步揭示那些在常規(guī)的真空包裝貯藏過程中難以有效控制的微生物種群，從而為尋找新的保鮮措施奠定良好的基礎(chǔ)。

國內(nèi)外有較多關(guān)于肉制品中脹袋微生物分離鑒定的報道，如Brightwell等[3]從脹袋的真空包裝羊肉中分離出的嗜冷腸桿菌；Silva等[4]從脹袋的巴西真空包裝牛肉中分離出的嗜冷梭狀芽孢桿菌。劉常金等[5]從脹袋的燒雞中分離出綠膿假單胞菌。徐世明等[6]從脹袋的烤雞中分離生孢梭狀桿菌、枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌等腐敗菌。楊穎等[7]研究發(fā)現(xiàn)朗比克假絲酵母與藤黃微球菌是導(dǎo)致脆梅脹袋的主要微生物。但是對于引起鮮藕片脹袋的特定腐敗微生物的研究鮮見報道。

目前，對于細(xì)菌和酵母菌的鑒定方法從傳統(tǒng)的生化鑒定，分子生物學(xué)方法，API和VITEK等智能鑒定系統(tǒng)，都實現(xiàn)了對菌種鑒定的高度準(zhǔn)確率。而前兩種方法操作復(fù)雜，費時，常采用一對一符合式鑒定模式，難以實現(xiàn)食品中快速檢測的需求，而VITEK 2 Compact菌種鑒定系統(tǒng)不僅克服了傳統(tǒng)菌種鑒定費時、操作要求高的缺點，而且也有較高的鑒定準(zhǔn)確率和較好的集成性[8]。喬寧等[9]利用該系統(tǒng)對20 株常規(guī)細(xì)菌的鑒定符合率為100%。

本研究旨在分離鑒定促使鮮切蓮藕真空包裝脹袋的微生物樣本，運用梅里埃VITEK 2 Compact菌種鑒定系統(tǒng)對所有的分離株進行鑒定，進而確定促使鮮切蓮藕真空包裝脹袋微生物種群。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“3735”蓮藕 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菜場。

革蘭氏染色液、美蘭染色液、孔雀綠染色液、生理鹽水、75%酒精（實驗室自行配制）。

1.2 培養(yǎng)基

用于細(xì)菌和真菌分離培養(yǎng)的培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉浸膏10.0 g、酵母浸膏5.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫-80 1.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、乙酸鈉 5.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、水合硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5 g、水合硫酸錳（MnSO4·4H2O）0.05 g，蒸餾水1 L，pH 6.0～6.5[10]。

1.3 儀器與設(shè)備

VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)儀（配有革蘭氏陰性菌、需氧芽孢桿菌和酵母菌鑒定卡） 法國生物梅里埃（中國）有限公司；DZ-500K型真空（充氣）包裝機 上海申越包裝機械制造有限公司；AR2140型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SPX-250B型生化培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；DEM光學(xué)顯微鏡 上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 鮮切藕片的制備

新鮮蓮藕經(jīng)清洗，切分（8 mm）后進行真空包裝（PA/PE復(fù)合袋），每袋放置6 片大小均一（直徑7～8 cm）的藕片置于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，收集脹袋樣本以備后續(xù)分離。

1.4.2 脹袋微生物的分離與純化

從脹袋的藕片包裝中以無菌操作方法稱取25 g，加入盛有225 mL 0.85%無菌生理鹽水的三角瓶中，振搖混勻，再以無菌生理鹽水依次進行10 倍的梯度稀釋[11]。取10－5、10－6、10－7稀釋液各0.1 mL分別涂布于MRS、PDA、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，為抑制細(xì)菌的污染，先在200 mL PDA培養(yǎng)基中加入l mL 100 mg/mL經(jīng)過濾除菌的頭孢霉素和2～3 滴25%的乳酸，再倒平板，分別于37 ℃（48 h）、25 ℃（72 h）、37 ℃（24 h）進行厭氧（燭缸法）和好氧培養(yǎng)。觀察并記錄主要脹袋菌的菌落特征，挑取優(yōu)勢單菌落分離純化（劃線3 次以上）[12]，最后接種到試管斜面于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 微生物反證實驗

將分離純化的菌株分別接種于斜面，用無菌生理鹽水制備成106～107CFU/mL菌濃的菌懸液，分別接種到已經(jīng)滅菌的藕片（用95%乙醇浸泡3 min，再用無菌水沖洗4～5 次）然后進行真空包裝封袋，放置于37 ℃的培養(yǎng)箱7 d，觀察是否有脹袋現(xiàn)象。每個菌種做3 個平行，沒有接種的無菌藕片（用無菌水浸泡5 min）作為陰性對照。

1.4.4 鏡檢

細(xì)菌：取1 環(huán)斜面培養(yǎng)物進行革蘭氏染色[10]，觀察個體形態(tài)和純度。

酵母菌：1）形態(tài)觀察：生理鹽水浸片法[10]；2）繁殖方式：美蘭染色法[13]；3）假菌絲觀察[13-14]；在培養(yǎng)皿中倒一薄層PDA培養(yǎng)基，凝固后倒置數(shù)小時使表面干燥并活化3 代后的菌株呈“Z”字形劃線接種。25 ℃培養(yǎng)1 d后，在新長出的少量菌體上輕輕覆蓋滅菌蓋玻片并繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)3～5 d后，用無菌鑷子取下蓋玻片放于劃線兩旁的缺氧區(qū)域是否形成假菌絲。4）子囊孢子觀察[10]：孔雀綠芽孢染色法。

1.4.5 菌種鑒定

細(xì)菌和酵母菌鑒定均采用VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 脹袋微生物的分離純化及菌種返接藕片的腐敗性觀察

真空包裝的鮮切藕片在37 ℃貯藏2 d就出現(xiàn)嚴(yán)重的脹袋情況，在第2天進行分離，采用平板計數(shù)法，結(jié)果在10－7稀釋液涂布的平板上3 種培養(yǎng)基上均有菌落產(chǎn)生。其中在NA培養(yǎng)基上有8 個典型菌株，在MRS培養(yǎng)基上有3 個典型菌株，在PDA培養(yǎng)基上有7 個典型菌株。分別以N1～N8，L1～L3和Y1～Y7表示，采用平板劃線法進一步分離純化，最后進行反證實驗，結(jié)果見表1。

表1 脹袋微生物反證實驗結(jié)果Table1 Disproof results for the presence of microorganisms in bulged packages

由表1可知，接種后的藕片貯藏7 d后，所有接種的藕片都出現(xiàn)了酸味，也有不同程度的軟化，表示分離的這幾種菌都有不同程度的致腐作用；N2、N6、Y1、Y3、Y4都出現(xiàn)了嚴(yán)重脹袋現(xiàn)象（n=3），打開包裝袋可以聞到強烈的酸味，也有不同程度的軟化。而其他接種的藕片和對照藕片放置7 d后仍然保持真空包裝的狀態(tài)，因此可以斷定N2、N6、Y1、Y3、Y4是引起藕片脹袋的主要菌株。

2.2 菌株的形態(tài)特征及腐敗菌的鑒定

經(jīng)過反證實驗后，N2、N6、Y1、Y3、Y4這5 個菌株的菌落形態(tài)特征和細(xì)胞形態(tài)特征見表2，5 個菌株的顯微形態(tài)見圖1。

表2 5 種微生物的形態(tài)特征Table2 Colony characteristics of 5 bacterial strains

為鑒定5 種菌株N2、N6、Y1、Y3、Y4，N2和N6采用GN和BCL檢測卡，Y1、Y3、Y4采用YST檢測卡,通過VITEK 2 Compact微生物自動鑒定系統(tǒng)作菌種鑒定，結(jié)果見表3～5。

圖1 5 株菌株菌體形態(tài)Fig.1 Microscopic morphology of 5 bacterial strains

表3 GN卡鑒定菌株N2Table3 Identification of strain N2 by GN card

表4 BCL卡鑒定菌株N6Table4 Identification of strain N6 by BCL card

表5 YST卡鑒定菌株Y1、Y3、Y4Table5 Identification of strains Y1, Y3 and Y4 by YST card

表6 脹袋微生物經(jīng)VITEK 2 Compact鑒定的結(jié)果Table6 Identification of microorganisms in bulged package by VITEK 2 Compact system

綜合形態(tài)特性與生理生化特性，根據(jù)《伯杰氏菌種鑒定手冊》[15]和《酵母菌的特征與鑒定手冊》[14]，結(jié)合VITEK 2 Compact的鑒定結(jié)果（表6），進一步確定這5 種菌分別為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、季也蒙假絲酵母（C. guilliermondii）、無名假絲酵母（C. famate）和葡萄牙假絲酵母（C. iusitaniae）。

真空包裝鮮切果蔬制品目前已經(jīng)很普遍，因為微生物污染，在貯藏期間，鮮切果蔬會出現(xiàn)腐敗和脹袋是2 個比較嚴(yán)重的問題，而很多研究也只針對于腐敗問題對其致腐微生物進行分離及鑒定。如趙國嬌等[16]對真空包裝的鮮切紫薯的菌相進行研究，發(fā)現(xiàn)整個貯藏過程中酵母菌數(shù)量優(yōu)勢明顯；方蘭蘭等[17]對真空包裝鮮切蓮藕中微生物進行分析，通過不同選擇性的細(xì)菌培養(yǎng)基分離出7 種細(xì)菌。本實驗就真空包裝鮮切藕片脹袋微生物的分離與鑒定作為探討真空包裝鮮切果蔬脹袋問題的依據(jù)，將為抑菌并延長真空包裝鮮切藕片保質(zhì)期提供參考。

3 討 論

本實驗以脹袋的真空包裝鮮切藕片為材料進行平板劃線分離純化，得到8 株細(xì)菌、3 株乳酸菌和 7 株酵母菌。為了驗證這18 株微生物是否為藕片的脹袋微生物，對其進行了反證實驗，結(jié)果表明：2 株細(xì)菌、3 株酵母菌可以造成藕片的脹袋。細(xì)菌和酵母菌在2 d內(nèi)就可以有一定程度的脹袋，7 d就達到了嚴(yán)重的脹袋還伴有酸臭味。

對反證實驗的菌株進行鑒定，發(fā)現(xiàn)2 株細(xì)菌分別為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），3 株酵母菌都屬于假絲酵母屬（Candida）。陰溝腸桿菌廣泛存在于自然界中，在人和動物的糞便水、泥土、植物中均可檢出，是腸道正常菌種之一，為條件致病菌。該菌能利用大多數(shù)碳水化合物在37 ℃發(fā)酵產(chǎn)氣，甘油或肌醇發(fā)酵不產(chǎn)氣[15]。蠟狀芽孢桿菌蠟樣芽孢桿菌分布很廣，土壤、空氣等均有分布，在植物性食品和許多生熟食品中也常見，可致食物腐敗和引起中毒[18]。對葡萄糖發(fā)酵的主要產(chǎn)物包括2,3-丁二醇、乙?；谆状?、甘油、乳酸、琥珀酸、甲酸、乙酸和CO2，產(chǎn)物因培養(yǎng)條件而不同[15]。分離的3 種酵母季也蒙假絲酵母、無名假絲酵母和葡萄牙假絲酵母都屬于假絲酵母屬，耐高滲透壓，許多種可發(fā)酵葡萄糖和其他糖類，能夠?qū)⑻寝D(zhuǎn)化為酒精和CO2[19]。這與劉翠云[20]在氣調(diào)包裝的蓮藕中分離出引起脹袋的酵母菌有一定的一致性。在真空包裝的肉禽產(chǎn)品中，芽孢桿菌、腸細(xì)菌和假絲酵母屬都是常檢出微生物[21]。如高鵬等[22]研究出芽孢桿菌屬和梭狀芽孢桿菌屬細(xì)菌的存在可能是引起真空包裝肘花脹袋從而使產(chǎn)品變質(zhì)的主要原因；黃玲等[23]從脹袋番茄醬中分離出季也蒙假絲酵母；王向陽等[24]從脹袋腌蘿卜干中分離出了蠟樣芽孢桿菌；王宏勛等[25]以真空包裝土豆研究了真空包裝凈菜的菌相組成，表明酵母菌是凈菜初始微生物中數(shù)量占優(yōu)勢的一種優(yōu)勢菌。雖然肉制品、醬制品和腌制品與鮮切果蔬加工工藝不盡相同，但由于其營養(yǎng)成分的相似都給微生物提供了適宜生長的環(huán)境，也導(dǎo)致了這些微生物代謝產(chǎn)生氣體最終導(dǎo)致脹袋。這就驗證了這5 種菌確實有導(dǎo)致脹袋的情況發(fā)生。

真空包裝的鮮切藕片的制作經(jīng)歷了蓮藕采摘、貯藏、清洗、去皮、切片、包裝這幾個步驟，為了減少人為增加的微生物污染，蓮藕在去皮、切片、包裝整個過程都是采用無菌操作，因此，可推斷，水源和蓮藕自帶的微生物是導(dǎo)致真空包裝鮮切藕片脹袋的根源，又由于蓮藕中含有水分、蛋白質(zhì)、糖分以及少量的維生素和其他有機物，在適宜的溫度貯藏下為細(xì)菌和酵母菌的生長創(chuàng)造了有利條件。本實驗通過分析鮮切藕片的脹袋微生物，為下一步進行脹袋微生物的溯源提供了依據(jù)，有助于尋找確切的污染源頭，在貯藏過程中加以重點控制，加強產(chǎn)品品質(zhì)提供保障。

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Isolation and Identification of Five Strains from Fresh-Cut Lotus Slices with Swollen Packages

LI Xin-nan, QI Xiao-bao, YAN Shou-lei, LI Jie, WANG Hong-bin, WANG Qing-zhang*
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Swollen bag of vacuum packaged fresh-cut lotus slices indicates deteriorated quality of products. In order to provide a useful guideline for solving this problem, the objectives of this study were to isolate microorganisms from the swollen package of fresh-cut lotus roots and to identify the isolates by using VITEK 2 Compact system. Five strains were isolated, including two bacteria, Enterobacter cloacae, Bacilllus cereus Frankland & Frankland, and three yeasts, Candida guilliermondii, Candida famate and Candida iusitaniae.

swollen package of fresh-cut lotus root; isolation; identification; VITEK 2 Compact system

TS201.3

A

1002-6630（2014）23-0151-04

10.7506/spkx1002-6630-201423030

2013-11-29

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD27B03）

李新楠（1989—），女，碩士，研究方向為食品保鮮。E-mail：lixinnan815@126.com

*通信作者：王清章（1953—），男，教授，學(xué)士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：Qingzw@mail.hzau.edu.cn