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    水牛奶酪蛋白膠束結構的熒光光譜研究

    2014-02-08 08:34:49楊同香陳俊亮吳孔陽李全陽李智麗康懷彬
    食品科學 2014年23期
    關鍵詞:藍移酪蛋白基團

    楊同香,陳俊亮,吳孔陽,李全陽,李智麗,康懷彬

    (1.河南科技大學食品與生物工程學院,河南 洛陽 471023;2.廣西大學輕工與食品工程學院,廣西 南寧 530004;3.洛陽師范學院生命科學學院,河南 洛陽 471022)

    水牛奶酪蛋白膠束結構的熒光光譜研究

    楊同香1,2,陳俊亮1,吳孔陽3,李全陽2,李智麗1,康懷彬1

    (1.河南科技大學食品與生物工程學院,河南 洛陽 471023;2.廣西大學輕工與食品工程學院,廣西 南寧 530004;3.洛陽師范學院生命科學學院,河南 洛陽 471022)

    利用內源熒光團色氨酸(Trp)和外源熒光探針8-苯胺基-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS)的熒光特性對水牛奶酪蛋白膠束結構進行研究。結果表明:當蛋白質質量濃度較低時,酪蛋白膠束結構變化不明顯,而較高的蛋白質質量濃度會破壞其膠束結構,使其疏水基團暴露;此外,在離子強度較大、pH值較低條件下,對酪蛋白膠束結構影響較大,使酪蛋白疏水基團暴露,酪蛋白微球先膨脹后聚集并形成酪蛋白膠束。

    酪蛋白;膠束結構;熒光光譜

    酸乳凝膠主要組分是蛋白質,牛奶中蛋白質以酪蛋白和乳清蛋白為主,其中酪蛋白占牛奶總蛋白含量的80%,乳清蛋白占20%。酪蛋白在酸乳凝膠制作過程中逐漸酸化,變性并發(fā)生聚集,最終形成立體網狀的膠束結構。目前,有關荷斯坦牛奶酪蛋白的分離[1-3]和結構解析[4-6]等研究已經相當成熟,但是,膠束粒度分布與離子強度大小間的關系尚不清楚[7],且對水牛奶酪蛋白的研究還較少。

    蛋白質各級結構解析的主要方法有圓二色譜法、熒光光譜、X射線衍射法、動態(tài)光散射技術等。熒光光譜主要通過疏水性表征蛋白質的膠束結構[8]。蛋白質形成三維結構的主要原因是氨基酸殘基的非極性側鏈之間疏水相互作用的結果,疏水相互作用對于維持蛋白質膠束結構具有重要作用[9]?;谇捌趯λD碳八D趟崛槟z的研究[10],本實驗主要通過熒光光譜分析影響蛋白結構變化的主要因素(pH值、離子強度和蛋白質量濃度)對酪蛋白膠束結構的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    水牛奶購于廣西南寧市聯(lián)利奶水牛農民專業(yè)合作社,其他試劑等均為分析純級及以上。

    1.2 儀器與設備

    超速冷凍離心機 美國Backman公司;Hettich離心機 德國Hettich公司;UV-1601紫外分光光度計、RF-5301PC熒光光度計 日本島津公司;PB10 pH計德國Sartorius公司。

    1.3 方法

    1.3.1 酪蛋白的分離純化

    分離方法按照文獻[1-3]。

    1.3.2 熒光光譜法表征水牛奶酪蛋白(casein,CN)膠束結構

    將酪蛋白凍干樣品用適量0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液溶解,樣品預處理同圓二色譜處理方法。配制溶液后,恒溫靜置 1.0 h,在激發(fā)波長為295 nm,測定酪蛋白在波長300~420 nm范圍內的熒光發(fā)射光譜[11]。

    1.3.2.1 pH值對酪蛋白Trp熒光特性的影響

    用0.01 mol/L磷酸緩沖溶液將樣品的pH值分別調至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,在室溫(25±1)℃下,測定其內源熒光強度,研究pH值對酪蛋白Trp熒光性的影響。

    1.3.2.2 離子強度對酪蛋白Trp熒光特性的影響

    用NaCl溶液將樣品的離子強度調節(jié)至0.01、0.05、0.08、0.1、0.2、0.3 mol/L,在室溫(25±1)℃、pH 7.0條件下測定其內源熒光強度,研究離子強度對酪蛋白Trp熒光性的影響。

    1.3.3 ANS熒光光譜法表征水牛奶CN膠束結構

    熒光探針選用8-苯胺基-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS),取一定量的樣品用各自的緩沖溶液稀釋蛋白質量濃度在0.04~0.20 mg/mL之間。 再加入20 μL的8 mmol/L的ANS熒光探針,混勻,避光15 min,然后于熒光分光光度計下比色,將激發(fā)波長設為390 nm,發(fā)射波長設為470 nm,測定樣品的熒光強度[12]。

    1.3.3.1 質量濃度對酪蛋白ANS熒光性的影響

    配制CN樣品質量濃度依次為12.5、25、50、100、200、400 μg/mL,離子強度為0.01 mol/L,pH 7.0,然后測定其熒光強度。

    1.3.3.2 pH值對酪蛋白ANS熒光特性的影響

    用0.01 mol/L磷酸緩沖溶液將樣品的pH值分別調至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,在室溫(25±1) ℃下測定其外源熒光強度,研究pH值對酪蛋白外源熒光性的影響。

    1.3.3.3 離子強度對酪蛋白ANS熒光特性的影響

    用NaCl溶液將樣品的離子強度調節(jié)至0.01、0.05、0.08、0.1、0.2、0.3 mol/L,在室溫(25±1)℃下測定其外源熒光強度,研究離子強度對酪蛋白外源熒光性的影響。

    2 結果與分析

    2.1 Trp熒光光譜法表征水牛奶CN膠束結構

    色氨酸(Trp)是一種很強的內源熒光團,對蛋白所處的極性環(huán)境具有高度敏感性。Trp位于折疊蛋白的內部疏水基團核心位置,最大發(fā)射波長約在335 nm。當Trp所處微環(huán)境從疏水性環(huán)境變?yōu)闃O性環(huán)境時,往往會使其本身的熒光發(fā)射波長發(fā)生紅移,同時伴隨著發(fā)射強度的降低。αs-CN有兩個Trp殘基,β-CN和κ-CN只有一個Trp殘基。對Trp進行熒光檢測可以有效地反映蛋白結構的變化[13]。

    圖1 水牛奶酪蛋白的內源熒光性受環(huán)境中離子強度的影響Fig.1 Intrinsic tryptophan fluorescence intensity of buffalo casein as a function of ionic strength

    檢測水牛奶CN內源熒光特性受環(huán)境中離子強度的影響。如圖1所示,當離子強度由0.01 mol/L增至0.05 mol/L時,CN內源熒光強度(If)輕微增大,但熒光最大發(fā)射波長(λmax)并未變化,這表明分子內部發(fā)生膨脹,給予酪氨酸(Tyr)和Trp等基團自由轉動度,這個過程由疏水性基團的水合作用完成,此時Trp依然保持在內部疏水環(huán)境中。當CN微環(huán)境中離子強度從0.1 mol/L增至0.3 mol/L時,CN內源If發(fā)生顯著增大,同時伴隨著λmax的藍移(從346 nm藍移至340 nm)。這表明Trp內部的剛性環(huán)境減弱,芳香族氨基酸殘基暴露,Trp殘基埋藏在疏水環(huán)境中,分子內Trp猝滅作用減弱,導致CN分子結構被破壞。隨環(huán)境中離子強度增大,CN發(fā)生折疊聚集,分子結構改變。St?nciuc[14]和Chakraborty[15]等對荷斯坦牛奶apo-α-乳白蛋白的研究指出λmax發(fā)生移動,則表示Trp內部疏水環(huán)境發(fā)生改變。

    圖2 水牛奶酪蛋白的內源熒光性受環(huán)境中pH值的影響Fig.2 Intrinsic tryptophan fluorescence intensity of buffalo casein as a function of pH

    由圖2可知,CN周圍環(huán)境由中性變弱堿性時,由于負電荷的加入,使分子內部靜電斥力增大,If降低。天然狀態(tài)下的Trp很可能被周圍的氨基酸分子淬滅了熒光特性[14,16]。而隨著pH值的降低,使得CN所處微環(huán)境的H+濃度增大,中和CN表面的負電荷,使其分子間的靜電斥力減弱,CN微球發(fā)生膨脹,形成熔球態(tài)。CN周圍環(huán)境在pH 6.0時,其If相對與天然狀態(tài)約增加了20%,伴隨分子內色氨酸淬滅和λmax的藍移。這表明色氨酸內部的剛性環(huán)境減弱,芳香族氨基酸殘基暴露,Trp殘基埋藏在疏水環(huán)境中。隨著CN微環(huán)境中pH值進一步降低,其相互作用也進一步加強,被其他氨基酸遮蔽的Trp殘基暴露,從而使內源If發(fā)生顯著增大,λmax發(fā)生藍移。pH 5.0條件下,Trp殘基分子內淬滅,使If相對與天然狀態(tài)約增加了39%,λmax從346 nm 藍移至 339 nm,表明色氨酸殘基進一步暴露在疏水性環(huán)境中。pH值的降低使CN分子結構發(fā)生改變。劉燕[17]對荷斯坦牛奶酪蛋白的Trp熒光性進行了研究,指出在pH 5.5~10范圍內,隨著pH值的升高,蛋白分子上的部分氨基酸去質子化現象導致CN膠束形成過程中,氫鍵和鹽鍵作用遭到破壞,同時分子間較強的靜電斥力使膠束結構變得疏松。

    2.2 ANS熒光光譜法表征水牛奶CN膠束結構

    ANS是一種疏水熒光染料,作為外源的熒光團追蹤監(jiān)測蛋白密集程度。相對于ANS在水溶液中的熒光參數,在存在蛋白的溶液中,ANS優(yōu)先占據溶液中易于接觸到的蛋白疏水基團或簇,If產生顯著增大,并伴隨著其最大發(fā)射波長(通常為530 nm藍移至470 nm)明顯的藍移。ANS熒光參數可以有效的檢測蛋白結構的變化,尤其是疏水區(qū)域暴露于溶劑中的中間態(tài)的變化[15,18]。為進一步探究CN微環(huán)境變化對其結構的影響,利用ANS熒光光譜分析水牛奶CN在不同蛋白質量濃度、不同pH值和離子強度環(huán)境條件下熒光特性的變化。

    圖3 水牛奶酪蛋白的外源熒光性受蛋白質量濃度的影響Fig.3 Relative fluorescence intensity of buffalo casein as a function of protein concentration

    如圖3所示,在水牛奶C N質量濃度較低時(12.5~25 μg/mL),ANS的最大發(fā)射波長并未發(fā)生藍移,表明CN單體分子的疏水區(qū)域無法與ANS 分子結合,只有當CN分子的疏水區(qū)自組裝形成膠束時,才能提供 ANS 結合所需的疏水結合位點。隨著CN質量濃度的增加(50~400 μg/mL),ANS熒光明顯發(fā)生藍移,從504 nm藍移至472 nm,并伴隨著If的顯著增強。CN外源熒光強度隨蛋白質量濃度的增大呈線性增大趨勢,擬合直線方程為:y = 0.979 5x + 46.082(R2 = 0.998 3)。這主要是由于CN質量濃度的增大,使得CN分子的疏水區(qū)域自組裝成膠束,更多的疏水基團暴露,從而使得ANS與疏水基團的結合位點增多,進而表現為ANS發(fā)生藍移,同時伴隨著If的增強。

    圖4 水牛奶酪蛋白的外源熒光性受環(huán)境離子強度的影響Fig.4 Relative fluorescence intensity of buffalo casein as a function of ionic strength

    圖5 水牛奶酪蛋白的外源熒光性受環(huán)境pH值的影響Fig.5 Relative fluorescence intensity of buffalo casein as a function of pH

    ANS的熒光特性與其所處微環(huán)境的極性有密切關系。ANS本身并無強熒光性,只有ANS與蛋白疏水基團相結合時,熒光性才會增強。由圖4、5可知,隨著CN環(huán)境中離子強度增大、pH值降低,ANS熒光強度呈顯著增強趨勢。酪蛋白ANS熒光圖譜隨著CN微環(huán)境中離子強度的增大發(fā)生明顯藍移,并伴隨著If的顯著增大。CN微環(huán)境中的離子強度0.30 mol/L時的熒光強度較離子強度0.10 mol/L時約升高了47%。這表明隨著離子強度的增大,伴隨著水合作用,CN暴露出更多的疏水基團,使ANS獲得更多的結合位點,從而使其If增強。隨著溶液pH降低,ANS熒光圖譜If顯著增大,同時λmax發(fā)生稍許藍移。在pH 7.0~7.5時,ANS的If與λmax并未發(fā)生明顯變化,說明CN天然狀態(tài)下,由于靜電斥力的作用,疏水基團被遮蔽,形成較好的動態(tài)平衡。隨著pH值降低,CN微環(huán)境中的質子增多,逐漸中和CN表面的負電荷,使靜電斥力減弱,而疏水基團暴露。隨著pH值進一步降低,靜電斥力繼續(xù)減弱,當pH值達到5.0時,暴露出更多的疏水基團,從而使其疏水性增強。

    3 討 論

    Liu Yan等[19]指出酪蛋白膠束主要通過靜電作用、疏水相互作用和氫鍵作用而形成,Chakraborty等[15]認為低pH值條件下,酪蛋白膠束由靜電相互作用形成,而且還指出酪蛋白分子先重排再展開,不同于其他球蛋白的構象變化。有研究表明酪蛋白膠束在大約pH 5.90時,已出現模糊的凝膠輪廓。在pH 5.40~5.35 時,乳蛋白開始聚合,且隨著pH值的降低,凝膠應力也逐步增強[20]。還有研究指出,在酸性條件下CN膠束主要是依靠疏水作用和氫鍵作用形成[17]。另外研究發(fā)現離子對酪蛋白膠束形成產生一定影響,在荷斯坦牛奶中添加NaCl可以提高酪蛋白膠束的水合作用[21-23]。而Huppertz等[24]認為NaCl改變了酪蛋白膠束的理化性質是由于NaCl中和了酪蛋白膠束表面電荷,從而改變了酪蛋白膠束的穩(wěn)定性。本實驗發(fā)現,隨著水牛奶CN質量濃度的增大,CN環(huán)境中離子強度的增大、pH值的降低,在靜電作用、疏水相互作用和氫鍵作用下,水牛奶CN分子結構遭到破壞,CN發(fā)生折疊、重排,疏水基團暴露,ANS熒光強度呈顯著增強趨勢。這些結果表明改變酪蛋白所處環(huán)境的離子強度、pH值均可影響酪蛋白膠束的結構。水牛奶酸化形成凝膠過程中,其膠束結構均發(fā)生變化,進而影響酸乳凝膠的質構特性,且乳蛋白含量對其凝膠形成也有一定的影響。

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    Structure of Casein Micelles from Buffalo Milk Determined by Fluorescence Spectroscopy

    YANG Tong-xiang1,2, CHEN Jun-liang1, WU Kong-yang3, LI Quan-yang2, LI Zhi-li1, KANG Huai-bin1
    (1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China; 2. Institute of Light Industry and Food Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China; 3. College of Life Science, Luoyang Normal University, Luoyang 471022, China)

    The structure of casein micelles from buffalo milk was analyzed by fluorescence spectroscopy with the extrinsic fluorescent probe 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS) and the intrinsic fluorophore tryptophan (Trp). The results showed that the effect of buffalo milk protein at low concentration on the structure of casein micelles was obvious. As the structure of casein micelles was broken, the hydrophobic groups were exposed to the solvent with high protein concentration. In addition, the structure of casein micelles was influenced evidently at higher ionic strength and lower pH level, which could cause exposure of hydrophobic groups of casein to the solvent so that the casein micelles could be formed by the expansion and aggregation of casein microspheres.

    casein; micelles structure; fluorescence spectroscopy

    TS252

    A

    1002-6630(2014)23-0084-04

    10.7506/spkx1002-6630-201423017

    2013-12-18

    河南科技大學博士科研啟動基金項目(09001785);國家自然科學基金面上項目(31071576)

    楊同香(1984—),女,講師,博士,研究方向為乳品科學與工程。E-mail:txyamy@163.com

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