老年慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期患者下呼吸道細(xì)菌定植與細(xì)胞免疫功能缺陷的關(guān)系研究

陳 謹(jǐn)，何耀紅，呼 瑋，朱瑞霞，劉淑梅，張 萍，崔建英

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種可以預(yù)防和治療的常見(jiàn)疾病，其特征是持續(xù)存在的氣流受限，氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展，與肺部對(duì)香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎性反應(yīng)有關(guān)[1]。國(guó)外部分研究表明老年COPD患者在穩(wěn)定期存在免疫功能低下，容易引起下呼吸道細(xì)菌定植(low airway bacterial colonization，LABC)，是促進(jìn)氣道炎性反應(yīng)并導(dǎo)致肺功能進(jìn)行性下降的重要原因[2]。本研究擬通過(guò)對(duì)老年COPD穩(wěn)定期患者的下呼吸道標(biāo)本做細(xì)菌培養(yǎng)并定量分析，測(cè)定痰及血中白介素8(IL-8)、高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)和痰免疫因子(CD4+、CD8+和CD4+/CD8+)水平來(lái)探索老年穩(wěn)定期COPD患者LABC與細(xì)胞免疫功能缺陷的關(guān)系，從而指導(dǎo)疾病的臨床治療工作。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2011年1月—2012年12月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)?fù)興醫(yī)院呼吸科慢病管理人群中確診的COPD患者220例，從中篩查出年齡≥65歲的患者106例，按研究標(biāo)準(zhǔn)選取60例患者，同時(shí)在體檢中心招募同年齡段健康志愿者30例。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)老年COPD患者，年齡≥65歲；(2)COPD診斷明確，符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸分會(huì)慢性阻塞性肺疾病診斷指南[3]，即吸入支氣管擴(kuò)張劑后1 s用力呼氣容積(FEV1)/用力肺活量(FVC)<70%，可逆實(shí)驗(yàn)陰性，COPD的嚴(yán)重程度分級(jí)按照肺功能分級(jí)；(3)COPD穩(wěn)定期：即既往6周無(wú)急性加重癥狀或罹患普通感冒及其他呼吸道感染性疾??；近4周未使用口服或靜脈抗生素；既往1年急性加重發(fā)作至少1次；試驗(yàn)前72～96 h內(nèi)停用H1-受體拮抗劑、β-受體阻斷劑(可能提高反應(yīng)性)、含咖啡因及可可堿的物質(zhì)(如咖啡)，72 h內(nèi)停用腎上腺皮質(zhì)激素類藥物及抗生素，48 h內(nèi)停用茶堿類，12 h內(nèi)停用β-受體興奮劑、抗膽堿能抑制劑，8 h內(nèi)停用色苷酸鈉等藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有哮喘、支氣管擴(kuò)張、支氣管腫瘤及其他明確肺部疾病的患者；(2)全身糖皮質(zhì)激素治療劑量>20 mg/d；(3)既往確診患有免疫系統(tǒng)疾?。?4)罹患其他感染性疾病者。(5)健康志愿者需近兩個(gè)月內(nèi)未服用不明成分中藥、酒精及免疫調(diào)節(jié)藥物。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)?fù)興醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意，并簽署知情同意書參加此項(xiàng)研究。

1.2 標(biāo)本收集

1.2.1 痰液收集

1.2.1.1 痰標(biāo)本收集及細(xì)菌定量 入選患者在醫(yī)生指導(dǎo)下漱口，深咳痰入無(wú)菌痰盒，無(wú)痰者則行3%氯化鈉溶液霧化10 min后導(dǎo)痰，留取深部痰，并測(cè)定誘導(dǎo)痰前后的肺功能。合格痰液(<2 h，鏡檢如多核白細(xì)胞>25個(gè)/低倍視野，鱗狀上皮細(xì)胞<10個(gè)/低倍視野，或兩者比例<1∶2.5為合格痰液)立即送檢。立即用無(wú)菌氯化鈉溶液沖洗痰液3次，用英國(guó)OXOID公司生產(chǎn)的Sputolysin使痰液均質(zhì)化后，再進(jìn)行細(xì)菌定量培養(yǎng)。Sputolysin與痰液比例為1∶1，此1∶1懸液視為原液(定量計(jì)算時(shí)加以校正)。預(yù)先準(zhǔn)備好4個(gè)無(wú)菌試管，每管含氯化鈉溶液4.5 ml。吸取混勻懸液0.5 ml加于第Ⅰ稀釋管內(nèi)(10-1)，再?gòu)牡冖裣♂尮軆?nèi)吸取混勻懸液0.5 ml加于第Ⅱ稀釋管內(nèi)(10-2)，依次稀釋，使第Ⅰ～Ⅳ試管內(nèi)痰液稀釋液分別為10-1～10-4。每次取痰液量0.01 ml接種于VX/苯乙醇血平皿和中國(guó)藍(lán)瓊脂培養(yǎng)皿及巧克力培養(yǎng)皿中。細(xì)菌生長(zhǎng)后，按常規(guī)做細(xì)菌菌種鑒定。本試驗(yàn)誘導(dǎo)痰是在監(jiān)測(cè)肺功能的情況下進(jìn)行的，安全、可靠。

1.2.1.2 痰液制備 將第1步留取的剩余的痰標(biāo)本(≥8 ml)用微量稱稱重，加4倍重量的0.1%二硫蘇糖醇(DTT)，用振蕩器震蕩旋轉(zhuǎn)15 min，并予吸管反復(fù)渦狀抽吸，直至痰液與DTT均勻混合為止。再將混懸液放入離心機(jī)以1 500 r/s離心10 min，上清液分裝，其中4 ml-80 ℃保存，備用。

1.2.2 血及血清標(biāo)本的收集 抽取患者血液5 ml，用離心機(jī)以1 500×g離心10 min，血清分裝，-80 ℃保存，備用。

1.3 方法 (1)采用美國(guó)RayBiotech試劑盒，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)測(cè)定痰液及血液中IL-8因子的水平。(2)高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)的測(cè)定采用乳膠凝集法分別測(cè)定COPD穩(wěn)定期患者和對(duì)照組血清hs-CRP。(3)痰T細(xì)胞亞群的測(cè)定應(yīng)用美國(guó)BD型流式細(xì)胞儀，以淋巴細(xì)胞群設(shè)門，以相應(yīng)的同型對(duì)照IgG染色細(xì)胞為陰性對(duì)照，每份樣品檢測(cè)1 000個(gè)細(xì)胞，用SimulSET型軟件分析結(jié)果。具體步驟如下：①試驗(yàn)前將所有試劑及標(biāo)本放置室溫溶解；②分別加入CD4+和CD8+抗體(Ab)和同型對(duì)照各20 μl，雙色標(biāo)記單抗試劑，混勻后室溫避光30 min。③加紅細(xì)胞溶血?jiǎng)? ml，室溫避光10 min后1 000 r/min離心10 min，棄去上清。④加磷酸鹽緩沖液(PBS)2 ml，洗滌1次，棄上清，再1 000 r/min離心10 min，棄去上清。再次加PBS 2 ml，1 000 r/min離心10 min，棄上清。⑤加500 μl PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)分析。

1.4 肺功能的測(cè)定 采用德國(guó)Jaceger公司Master PET設(shè)備測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。通氣測(cè)定FEV1、FVC及FEV1/ FVC。肺功能分級(jí)方法：輕度:FEV1≥80%；中度：50%≤FEV1<80%；重度：30%≤FEV1<50%；極重度：FEV1<30%。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 觀察組因痰液不合格剔除6例，距測(cè)定時(shí)間4周內(nèi)服用抗生素剔除4例，最終納入觀察組50例，對(duì)照組30例。兩組患者吸煙量、住院≥1次人數(shù)、FEV1、FEV1/FVC相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

2.2 痰標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果 老年COPD穩(wěn)定期患者痰培養(yǎng)陽(yáng)性者共32例(64.0%)，其中4例合并有2種致病菌，故共檢出致病菌36株。主要是流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌、副流感嗜血桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌及真菌，分別占27.8%、16.7%、13.9%、11.1%、8.3%、8.3%、5.6%、5.6%、2.7%，見(jiàn)表2。定量分析結(jié)果顯示30例(60.0%)COPD穩(wěn)定期患者痰菌落計(jì)數(shù)大于106cfu/ml，確定為細(xì)菌定植，存在的致病菌分別為大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和真菌。

對(duì)照組中無(wú)致病菌檢出，只有1例檢出草綠色鏈球菌，其為口腔正常菌群，考慮由痰液污染引起。

2.3 不同肺功能分級(jí)的患者LABC情況 入選的老年COPD穩(wěn)定期患者肺功能損傷全部在中度以上，其中有4例存在兩種致病菌，占11.1%。肺功能分級(jí)中度者20例，細(xì)菌定植陽(yáng)性率為50.0%(10/20)；重度者23例，細(xì)菌定植陽(yáng)性率為65.2%(15/23)；極重度者7例，其中細(xì)菌定植陽(yáng)性5例。

表1 兩組臨床資料比較

注：△為χ2值，余檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量值為t值，-為Fisher確切概率法；FEV1=1 s用力呼氣容積，F(xiàn)VC=用力肺活量

表2 老年COPD穩(wěn)定期患者LABC情況

注：細(xì)菌定植數(shù)量均已進(jìn)行對(duì)數(shù)處理；COPD=慢性阻塞性肺疾病，LABC=下呼吸道細(xì)菌定植

2.4 不同定植情況患者細(xì)胞炎性因子水平比較 定植組與無(wú)定植組相比痰IL-8、血IL-8及血hs-CRP差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表3)。

Table3 Comparison of inflammatory cytokine between LABC and without LABC groups

組別例數(shù)痰IL-8(ng/L)血IL-8(ng/L)血hs-CRP(mg/L)定植組3040873±286096349±42981215±813無(wú)定植組2024261±85523666±1191 650±397 t值270353213P值001000004

注：IL-8=白介素8，hs-CRP=高敏C反應(yīng)蛋白

2.5 老年COPD穩(wěn)定期患者LABC痰細(xì)胞免疫因子水平 與對(duì)照組相比，定植組CD4+下降(q=11.64)，CD8+升高(q=7.65)，CD4+/CD8+比值倒置(q=10.60)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組相比，無(wú)定植組CD4+/CD8+(q=4.90)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與定植組相比，無(wú)定植組CD4+(q=8.82)、CD8+(q=4.22)、CD4+/CD8+(q=4.57)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

Table4 Comparison of cell immune factor among control group,LABC group and without LABC group

組別例數(shù)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+對(duì)照組303840±4922432±876189±090無(wú)定植組203637±8262896±745129±027定植組302506±5973644±930073±031F值451160318P值001002001

3 討論

本研究結(jié)果證實(shí)，部分老年穩(wěn)定期COPD患者存在LABC，這與國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果相同[4-5]。正常人下呼吸道是無(wú)菌的，因?yàn)闄C(jī)體存在完善的防御系統(tǒng)，但對(duì)于吸煙且存在氣道阻塞的COPD患者，由于肺部防御體系的損害導(dǎo)致下呼吸道病原體清除障礙[6]，使COPD患者在穩(wěn)定期時(shí)下呼吸道仍攜帶有細(xì)菌，即存在細(xì)菌定植。本研究也證實(shí)COPD患者與對(duì)照組在細(xì)菌定植方面有較大的不同。

本研究結(jié)果顯示下呼吸道致病菌的檢出率為64.0%，檢出率較高，同時(shí)細(xì)菌定植量也較大，痰標(biāo)本菌落計(jì)數(shù)大于106cfu/ml的占60.0%。因?yàn)楸狙芯繉?duì)象為老年患者，因此細(xì)菌定植率略高于其他國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果[7-8]。致病菌以流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌為主，分別占27.8%和16.7%，其次可見(jiàn)卡他莫拉菌、副流感嗜血桿菌分別占13.9%、11.1%，這也與國(guó)內(nèi)外的報(bào)道相似[4，9]。除上述常見(jiàn)致病菌外，還可見(jiàn)一些院內(nèi)感染致病菌如大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌及真菌等。其中4例患者可檢出1種以上的致病菌，占11.1%，而這些患者都有1次以上住院經(jīng)歷。本組患者肺功能以中、重度阻塞性通氣功能為主，肺功能損傷越重的患者，細(xì)菌定植率越高。

COPD穩(wěn)定期患者中，存在細(xì)菌定植的患者痰IL-8和血IL-8水平高于無(wú)定植的患者，hs-CRP水平亦高于無(wú)定植的患者。有研究表明，中重度COPD穩(wěn)定期患者可因?yàn)橄潞粑兰?xì)菌定植而導(dǎo)致菌落數(shù)量增加，從而促進(jìn)炎性反應(yīng)，使氣道發(fā)生一系列病理變化，包括炎性因子的升高使COPD急性加重趨于頻繁[10]，本研究中也可以得出相似的結(jié)論。IL-8是最重要的細(xì)胞因子，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的中性粒細(xì)胞趨化因子，是中性粒細(xì)胞活化的標(biāo)志。大量的中性粒細(xì)胞長(zhǎng)期聚集，分泌多種細(xì)胞因子作用于氣道局部，可以加重并延長(zhǎng)炎性反應(yīng)，因此痰中的IL-8水平明顯高于血中的IL-8水平。同時(shí)IL-8的趨化作用和誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞脫顆粒作用有助于對(duì)病原微生物的殺傷效應(yīng)，而細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物又會(huì)使呼吸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，并因正反饋?zhàn)饔檬寡仔孕?yīng)放大，進(jìn)而導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)。COPD患者系統(tǒng)炎性反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制目前尚不清楚，目前有兩種觀點(diǎn)，第一種觀點(diǎn)認(rèn)為COPD患者肺內(nèi)的炎性反應(yīng)及其代償事件導(dǎo)致炎性反應(yīng)的“溢出”[11]，因?yàn)镃OPD患者體循環(huán)中也存在有類似氣道炎性反應(yīng)改變的因素，故有學(xué)者認(rèn)為是氣道炎性反應(yīng)的“外溢”引起了系統(tǒng)炎性反應(yīng)[12]。而第二種觀點(diǎn)認(rèn)為，COPD的肺部表現(xiàn)只是全身系統(tǒng)性炎性反應(yīng)所累及的一個(gè)臟器。總之，既可以是系統(tǒng)性炎性反應(yīng)起源于肺部炎性反應(yīng)的“溢出”，也可能是多器官疾病造成系統(tǒng)性炎性反應(yīng)的肺部表現(xiàn)[13]，具體的原因尚需進(jìn)一步研究。CRP是肝臟合成的一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，是反映機(jī)體感染的敏感指標(biāo)，尤其是hs-CRP。肺部感染引起局部組織炎性反應(yīng)損傷，其炎性反應(yīng)及組織損傷物質(zhì)大量進(jìn)入肺循環(huán)，產(chǎn)生免疫反應(yīng)，刺激各種細(xì)胞因子，通過(guò)相應(yīng)的細(xì)胞因子介導(dǎo)在肝臟合成全身的CRP物質(zhì)，導(dǎo)致機(jī)體反應(yīng)性的CRP升高。但當(dāng)感染控制和組織修復(fù)后CRP可迅速恢復(fù)，與疾病變化同步[14]。同時(shí)引起hs-CRP升高的原因還有高血壓、冠心病、代謝綜合征等疾病[15]，本次研究對(duì)象為COPD穩(wěn)定期患者，定植組與無(wú)定植組的患者h(yuǎn)s-CRP水平有差異，氣道炎性反應(yīng)是否通過(guò)外周血hs-CRP反映出來(lái)還有待進(jìn)一步探索。

COPD穩(wěn)定期患者定植組患者CD4+、CD8+、CD4+/CD8+與健康人相比有差異，CD4+減少，CD8+升高，CD4+/CD8+甚至出現(xiàn)倒置情況。機(jī)體維持正常的免疫功能狀態(tài)依賴于各種免疫細(xì)胞，特別是各類T細(xì)胞亞群之間的相互協(xié)作和制約，產(chǎn)生適度的免疫應(yīng)答。越來(lái)越多的證據(jù)表明，COPD進(jìn)展惡化的原因除病原微生物的侵襲外，還與機(jī)體免疫功能缺陷有關(guān)。COPD患者的免疫功能低下和紊亂表現(xiàn)為CD4+降低，CD8+升高，CD4+/CD8+比值降低，甚至倒置，本研究的結(jié)果與其一致。Tsoumakidou等[16]研究表明，CD4+/CD8+比值是反映機(jī)體免疫紊亂敏感指標(biāo)，其比值的降低是機(jī)體免疫下降的重要標(biāo)志，下降程度與疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后不良密切相關(guān)。提示老年COPD穩(wěn)定期患者下呼吸道細(xì)菌存在定植時(shí)機(jī)體免疫功能降低，T淋巴細(xì)胞擴(kuò)增減少，影響抗原提呈，同時(shí)機(jī)體免疫功能缺陷時(shí)，機(jī)體的防御機(jī)制破壞，也容易導(dǎo)致COPD穩(wěn)定期患者的LABC[17-18]。

對(duì)痰液標(biāo)本的檢測(cè)是研究COPD的重要方法之一。在以往的試驗(yàn)方法中，多數(shù)學(xué)者通過(guò)患者自行咳痰；用不同水平的氯化鈉溶液行痰誘導(dǎo)留取標(biāo)本；用吸痰管吸取深部痰液及纖支鏡肺泡灌洗等方法獲取痰液。前兩種方法雖簡(jiǎn)單，但患者配合度差，痰液合格率低；后兩種方法對(duì)于患者來(lái)說(shuō)，痛苦較大，對(duì)氣道黏膜也有一定的損傷，不易進(jìn)行。因此在本次研究中進(jìn)行痰誘導(dǎo)，而且所有進(jìn)行痰誘導(dǎo)的患者均在嚴(yán)密監(jiān)測(cè)肺功能的情況下進(jìn)行，未出現(xiàn)不良反應(yīng)，并提高了痰標(biāo)本的合格率，因此是安全、可行的。

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18 葉長(zhǎng)廣.慢性阻塞性肺疾病急性加重與非侵襲性氣道真菌感染相關(guān)性研究[J].實(shí)用心腦肺血管病雜志， 2013，21(6)：24

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關(guān)于慢性阻塞性肺疾病與細(xì)菌定植關(guān)系的假說(shuō)如下：(1)惡性循環(huán)假說(shuō): 吸煙者的黏膜纖毛清除能力受損和局部免疫抑制使得細(xì)菌病原體較易在下呼吸道定植，這些定植的病原體及其產(chǎn)物又可通過(guò)增多氣道黏液分泌、破壞纖毛運(yùn)動(dòng)能力和損傷氣道內(nèi)皮等進(jìn)一步引起氣道黏膜纖毛清除能力的損傷，從而使得細(xì)菌病原體在下呼吸道的長(zhǎng)期定植更加容易。這種細(xì)菌及其產(chǎn)物對(duì)黏膜上皮細(xì)胞的潛在損傷作用在大氣道可有利于細(xì)菌的殘留，在小氣道則有助于形成細(xì)支氣管炎逐漸引起支氣管阻塞。(2)新致病菌株學(xué)說(shuō)：慢性阻塞性肺疾病的急性加重期可以檢出新致病菌株，而檢出的這些新致病菌菌株被認(rèn)為與急性加重的發(fā)生密切相關(guān)，表明慢性阻塞性肺疾病的急性加重是由新致病菌株的感染造成。(3)細(xì)菌定量假說(shuō)：慢性阻塞性肺疾病急性加重或其他癥狀的出現(xiàn)可能與呼吸道內(nèi)細(xì)菌濃度的閾值有關(guān)。一旦超過(guò)閾值，就會(huì)出現(xiàn)氣道炎癥反應(yīng)，從而產(chǎn)生臨床癥狀，且不同患者的閾值不同，這與患者的個(gè)體差異、病程、基礎(chǔ)疾病、免疫狀態(tài)等多方面的修正因素，以及細(xì)菌類型、寒冷和空氣污染對(duì)閾值的影響有關(guān)。