循環(huán)腫瘤細(xì)胞預(yù)測肝細(xì)胞癌患者臨床預(yù)后價值的Meta分析

曹宇勃，許崇安

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居全球惡性腫瘤第6位，病死率高居第3位[1-2]。我國是乙型肝炎大國，約有3 000萬慢性病毒性肝炎患者，而慢性病毒性肝炎可逐漸演變?yōu)楦斡不?，其?0%左右的肝硬化患者晚期可合并肝癌，我國已成為全世界肝癌高發(fā)地區(qū)之一[3-5]。與肝癌發(fā)生相關(guān)的主要危險因素有酗酒、黃曲霉素攝入、乙型肝炎病毒(HBV)感染和丙型肝炎病毒(HCV)感染等[6-7]。隨著人類基因組學(xué)對肝臟腫瘤分子機制研究的不斷深入，人們已經(jīng)意識到肝癌的發(fā)生與發(fā)展是個極其復(fù)雜的病理生理過程，與多種基因突變及其表觀遺傳學(xué)改變有關(guān)[8-9]。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)指脫離了原發(fā)病灶，侵襲并進(jìn)入血液循環(huán)的癌細(xì)胞，也稱之為“播撒腫瘤細(xì)胞”(disseminated tumor cells，DTCs)。早在1869年，澳大利亞學(xué)者Ashworth就發(fā)現(xiàn)死于轉(zhuǎn)移癌患者的血液中存在一種與原發(fā)腫瘤細(xì)胞相似的細(xì)胞，由此首次提出了CTCs的概念[9-10]。相關(guān)研究證實，CTCs的存在可能是惡性腫瘤在遠(yuǎn)處形成轉(zhuǎn)移性病灶的中間過程，與患者的臨床預(yù)后有著密切關(guān)系[11]。近年來，敏感分子技術(shù)的發(fā)展使分離和計數(shù)外周血中的CTCs成為可能。在疾病早期階段，CTCs有助于良、惡性腫瘤的鑒別，轉(zhuǎn)移風(fēng)險的預(yù)測和判斷；在疾病進(jìn)展期，CTCs能提供重要的預(yù)后信息，有助于醫(yī)生監(jiān)測治療效果。此外，CTCs能反映腫瘤特征，指導(dǎo)治療方案的制定，故可以作為靶向治療的靶標(biāo)[12]。大量研究表明，外周血CTCs是預(yù)測HCC患者預(yù)后的可靠生物學(xué)指標(biāo)，可在治療過程中及時有效地監(jiān)測HCC患者臨床治療效果并可隨時預(yù)測疾病進(jìn)展情況和患者預(yù)后生存期[12-13]。然而，也有部分研究認(rèn)為外周血CTCs對于預(yù)測HCC患者預(yù)后臨床意義不大[14]。鑒于既往研究的爭議性結(jié)果，本Meta分析通過全面收集相關(guān)研究來評價外周血CTCs預(yù)測HCC患者臨床預(yù)后的真實價值，以期為HCC的臨床診斷和治療提供參考依據(jù)和幫助。

1 資料與方法

1.1 資料檢索 計算機檢索PubMed、EMBase、Web of Science、Cochrane Library、CISCOM、CINAHL、Google學(xué)術(shù)、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(CBM)和中國知網(wǎng)等中英文數(shù)據(jù)庫，手工檢索相關(guān)參考文獻(xiàn)，檢索時間從其建庫至2013-08-01，文獻(xiàn)檢索策略采用主題詞和自由詞結(jié)合的原則，檢索詞主要包括：循環(huán)腫瘤細(xì)胞、circulating tumor cells、embolic tumor cells、disseminated tumor cells、肝癌、hepatocellular carcinoma、HCC、prognosis、預(yù)后、survival、生存期等。手工檢索納入文獻(xiàn)的參考文獻(xiàn)以發(fā)現(xiàn)潛在符合納入標(biāo)準(zhǔn)的研究。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)外周血CTCs預(yù)測HCC患者預(yù)后的臨床研究。(2)患者均經(jīng)病理組織學(xué)證實為HCC；(3)納入文獻(xiàn)均提供完整的HCC患者預(yù)后的數(shù)據(jù)資料如總生存期(OS)、無復(fù)發(fā)生存期(RFS)、無病生存期(DFS)等；(4)語言均為中文或英文。不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)將被剔除。同一作者采用相同病例進(jìn)行了多項研究并發(fā)表，則僅納入樣本量最大的研究或者最近發(fā)表的研究。

1.3 數(shù)據(jù)提取 采用統(tǒng)一制定的數(shù)據(jù)收集表，由兩位研究者分別獨立提取納入文獻(xiàn)數(shù)據(jù)資料，主要數(shù)據(jù)信息包括：第一作者、發(fā)表時間、國家、種族、診斷、性別、檢測方法、CTCs表達(dá)情況、結(jié)局指標(biāo)。如存在爭議，通過與第三方討論解決分歧。

1.4 納入文獻(xiàn)質(zhì)量評分 由兩位研究者根據(jù)NOS(Newcastle-Ottawa Scale)分別對納入文獻(xiàn)的質(zhì)量進(jìn)行評價[15]。NOS滿分為 9 分，包括觀察組和對照組研究對象的定義和選擇、兩組的可比性、暴露因素3方面內(nèi)容?！?分為高質(zhì)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用STATA 12.0(Stata Corp，College Station，TX，USA)軟件進(jìn)行。采用固定效應(yīng)模型或隨機效應(yīng)模型計算危險比(HR)及其95%可信區(qū)間(95%CI)評價CTCs陽性和CTCs陰性HCC患者預(yù)后差異，并對合并效應(yīng)值進(jìn)行Z檢驗。各研究間異質(zhì)性采用CochranQ檢驗進(jìn)行評價，若P<0.05則提示異質(zhì)性差異有統(tǒng)計學(xué)意義[16]；此外，采用I2檢驗定量評價異質(zhì)性大小，I2值介于0%～100%[17]，I2值越大提示異質(zhì)性越明顯；如異質(zhì)性檢驗P<0.05或I2>50%則提示各研究間存在異質(zhì)性，故采用隨機效應(yīng)模型(DerSimonian Laird法)分析，反之則采用固定效應(yīng)模型(Mantel-Haenszel法)分析。根據(jù)種族、臨床診斷和檢測方法進(jìn)行了亞組分析以探究各組間異質(zhì)性來源，并逐一刪除納入研究進(jìn)行敏感性分析以評價單一研究對總體結(jié)果的影響。采用Begger漏斗圖和Egger線性回歸分析納入文獻(xiàn)是否存在發(fā)表偏移以評價原始分析結(jié)果的真實可靠性[18]。

2 結(jié)果

2.1 納入研究的基線特征 最初檢索到相關(guān)文獻(xiàn)385篇，根據(jù)其題目和關(guān)鍵詞剔除208篇，進(jìn)一步閱讀摘要和全文后剔除165篇，最終12項隊列研究符合納入標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)入本Meta分析[19-30]。納入研究的發(fā)表時間1997—2013年。文獻(xiàn)納入篩選流程見圖1。過去十年電子數(shù)據(jù)庫中與主題相關(guān)的文獻(xiàn)數(shù)量的分布見圖2。納入的12項研究包括1 133例HCC患者，其中CTCs陽性患者559例和CTCs陰性患者574例。8項來自于歐美人群，其余4項來自于亞洲人群。8項采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法檢測外周血CTCs表達(dá)情況，其余4項采用CellSearch法進(jìn)行檢測。12項納入文獻(xiàn)總體質(zhì)量較高，除1項研究質(zhì)量評分為5分之外，其余研究質(zhì)量評價均≥6分。納入研究的基線特征和質(zhì)量評價見表1。

2.2 Meta分析結(jié)果 各研究間存在異質(zhì)性(均I2>50%，P<0.05)，故采用隨機效應(yīng)模型分析。Meta分析結(jié)果顯示：CTCs陽性HCC患者的OS和RFS短于CTCs陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義〔OS：HR=1.53，95%CI(0.98，2.07)，P<0.001；RFS：HR=3.14，95%CI(0.70，5.58)，P=0.012〕。CTCs陽性患者與CTCs陰性患者的DFS差異無統(tǒng)計學(xué)意義〔HR=1.35，95%CI(-0.75，3.46)，P=0.207,見圖3〕。

根據(jù)種族不同進(jìn)行亞組分析發(fā)現(xiàn)，歐美人群和亞洲人群CTCs陽性患者OS與RFS均短于CTCs陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義〔歐美人群：HR=2.09，95%CI(1.29，2.89)，P<0.001；亞洲人群：HR=1.14，95%CI(0.65，1.64)，P<0.001,見圖4〕。

根據(jù)臨床診斷不同進(jìn)行亞組分析顯示，CTCs陽性的原發(fā)性和繼發(fā)性HCC患者OS與RFS均短于CTCs陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義〔原發(fā)性HCC：HR=1.14，95%CI(0.70，1.57)，P<0.001；繼發(fā)性HCC：HR=2.54，95%CI(1.54，3.55)，P<0.001，見圖5〕。

根據(jù)不同檢測方法進(jìn)行亞組分析發(fā)現(xiàn)，在qRT-PCR 和CellSearch 亞組中CTCs陽性患者OS與RFS均短于CTCs陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義〔qRT-PCR：HR=1.36，95%CI(0.87，1.86)，P<0.001；CellSearch：HR=2.57，95%CI(1.19，3.94)，P<0.001，見圖6〕。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖

圖2 外周血CTCs預(yù)測HCC患者臨床預(yù)后相關(guān)文獻(xiàn)的年限分布圖

Figure2 Distribution of the number of years of topic-related literatures in the electronic database

注：RFS=無復(fù)發(fā)生存期,OS=總生存期,DFS=無病生存期

圖3 CTCs陽性與CTCs陰性HCC患者的RFS、OS、DFS比較

Figure3 Comparison of RFS,OS and DFS between the CTCs-positive and CTCs-negative HCC patients

2.3 敏感性分析與發(fā)表偏移 采用單因素及多因素回歸分析探討異質(zhì)性來源，結(jié)果表明任何因素均不是異質(zhì)性的主要來源(均P>0.05,見表2)。逐一刪除納入研究進(jìn)行敏感性分析以評價單一研究對總體結(jié)果的影響，結(jié)果表明無單一研究可顯著影響原始分析和亞組分析結(jié)果的差異(見圖7)。Begger漏斗圖圖形對稱，提示無明確發(fā)表偏移(見圖8)。Egger線性回歸分析進(jìn)一步證實納入文獻(xiàn)無發(fā)表偏移(t=-0.68，P=0.513)。

3 討論

CTCs是自發(fā)或因診療操作由實體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞[31]。大部分腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后被免疫系統(tǒng)識別并清除，但是少量腫瘤細(xì)胞會獲得新的特征而在血液中存活，這些細(xì)胞即是CTCs；未被清除的CTCs通過遷移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，并在一定條件下發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶[32]。既往研究表明，外周血中CTCs的含量與惡性腫瘤的治療效果和預(yù)后有密切的關(guān)系。HCC是世界上最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年有564 000例新發(fā)病例，其5年生存率不足5%[33-35]。因此，尋找方便、快速、準(zhǔn)確的生物標(biāo)志物以早期診斷HCC、預(yù)測HCC患者臨床治療療效及預(yù)后已成為近年來的研究熱點[36]。最新研究表明，外周血CTCs可作為HCC療效評估指標(biāo)及加強輔助化療的選擇性指標(biāo)，有助于建立個體化治療方案，從而降低HCC復(fù)發(fā)率，延長患者生存期，使HCC的綜合治療更加及時、完善、有效[37]，但該觀點尚存在爭議。

表1 納入文獻(xiàn)基線特征與質(zhì)量評分

注：CTCs=循環(huán)腫瘤細(xì)胞，HCC=肝細(xì)胞癌，qRT-PCR=實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng),RFS=無復(fù)發(fā)生存期,OS=總生存期,DFS=無病生存期

表2 異質(zhì)性來源單因素及多因素回歸分析結(jié)果

Table2 Univariate and multivariate regression analyses of potential source of heterogeneity

因素偏回歸系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤Z值P值95%CI年限 單因素-01670096-1740083(-0356，0022) 多因素-01640122-1350178(-0403，0075)國家 單因素003603570100919(-0663，0736) 多因素160310291560120(-0415，3620)種族 單因素045710110450652(-1525，2438) 多因素-15690769-1220072(-1917，1222)診斷 單因素071109380760448(-1128，2550) 多因素178414021410160(-0075，3493)檢測方法 單因素151108061870061(-0070，3091) 多因素197509522050058(-0129，3820)生存期 單因素016106130260793(-1041，1362) 多因素-05870469-1250210(-1506，0332)

圖4 不同種族CTCs陽性與CTCs陰性患者預(yù)后比較

Figure4 Comparison of prognosis between CTCs-positive and CTCs-negative HCC patients of different ethnicity

圖5 不同臨床診斷CTCs陽性與CTCs陰性患者預(yù)后比較

Figure5 Comparison of prognosis between CTCs-positive and CTCs-negative patients with primary and metastatic HCC

圖6 不同檢測方法CTCs陽性與CTCs陰性患者預(yù)后比較

Figure6 Comparison of prognosis between CTCs-positive and CTCs-negative HCC patients with different detection method

圖7 單一研究對總體結(jié)果影響的敏感性分析結(jié)果

Figure7 Sensitivity analysis of the influence of each individual study on the pooled HRs by omitting individual studies

圖8 評價發(fā)表偏移的Begger倒漏斗圖

Figure8 Begger′s funnel plots of the potential publication bias of included studies

本Meta分析評價外周血CTCs預(yù)測HCC患者預(yù)后，共計12項隊列研究被納入，Meta分析結(jié)果顯示，外周血CTCs陽性患者的OS與RFS低于CTCs陰性患者，提示外周血CTCs可能與HCC患者臨床預(yù)后有著密切關(guān)系。眾所周知，CTCs可在血液中形成微小癌栓，并在一定條件下發(fā)展為轉(zhuǎn)移病灶，加快腫瘤的進(jìn)展。已有研究表明，部分肝癌患者肝癌切除或肝移植前，已有腫瘤細(xì)胞脫落進(jìn)入血循環(huán)系統(tǒng)中，從而導(dǎo)致肝癌血行轉(zhuǎn)移[6]。雖然HCC的具體發(fā)病機制尚不明確，但已有研究表明外周循環(huán)血中CTCs的檢測及評估可以指導(dǎo)HCC治療、預(yù)測預(yù)后、判斷治療效果、監(jiān)測腫瘤的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，是一種具有高度可行性的、信息含量高的新型診斷手段[38]。亞組分析結(jié)果表明，亞洲人群和歐美人群CTCs陽性患者預(yù)后均差于CTCs陰性患者，提示CTCs預(yù)測HCC患者預(yù)后無明顯種族差異，適合各種人群HCC患者的療效預(yù)測及預(yù)后判定。以上結(jié)果與既往研究結(jié)果基本一致，提示CTCs可作為預(yù)測HCC患者預(yù)后重要的生物學(xué)指標(biāo)。

然而本研究也存在一定的局限性：首先，納入文獻(xiàn)過少可能影響本Meta分析結(jié)果的統(tǒng)計效能，故仍需大樣本量進(jìn)一步證實。其次，作為回顧性研究，Meta分析可能存在選擇性偏移，從而影響研究結(jié)果的可信度。再次，由于無法獲取納入研究的原始數(shù)據(jù)，因而限制了CTCs檢測對HCC患者預(yù)后價值的深入探討。盡管納入研究均有明確的納入標(biāo)準(zhǔn)，但仍存在未考慮到的潛在因素影響分析結(jié)果。因此，需進(jìn)一步擴大樣本量來探討CTCs對HCC患者預(yù)后的預(yù)測價值。

綜上所述，現(xiàn)有證據(jù)表明：CTCs陽性HCC患者的OS和RFS均劣于CTCs陰性患者。檢測外周血中CTCs對判斷HCC的臨床預(yù)后具有重要意義。本研究結(jié)論初步闡釋了外周血CTCs表達(dá)情況與HCC臨床預(yù)后的關(guān)系，為深入了解HCC疾病進(jìn)展的具體機制提供了線索；同時，也為HCC的早期診斷、治療指導(dǎo)及預(yù)后判斷提供了理論依據(jù)。

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