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    p65小干擾RNA對人臍靜脈內(nèi)皮細胞再灌注后趨化因子CXCL16表達的影響

    2014-04-24 02:09:44符秀虹蒙緒卿陳積雄
    中國全科醫(yī)學 2014年12期
    關(guān)鍵詞:趨化因子存活率內(nèi)皮細胞

    曾 敏,魏 欣,李 偉,符秀虹,蒙緒卿,陳積雄,王 萍

    炎癥反應(yīng)是缺血再灌注細胞損傷的重要環(huán)節(jié),其中許多黏附因子和趨化因子都有參與。近年來,越來越多的研究顯示趨化因子CXCL16參與了心血管疾病的炎癥反應(yīng)。內(nèi)皮細胞處于血管最內(nèi)層,對于冠狀動脈的缺血缺氧、內(nèi)環(huán)境的微小變化最敏感、最迅捷。因此,本研究選擇人臍靜脈內(nèi)皮細胞作為研究對象,通過對其進行體外模擬缺血再灌注培養(yǎng),并采用小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)轉(zhuǎn)染的方法探討缺血再灌注中趨化因子CXCL16的表達及可能的調(diào)節(jié)機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料和試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細胞 (HUVEC)(購自ATCC),采用添加了內(nèi)皮細胞生長物、5%胎牛血清和青/鏈霉素的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng) (購自美國科學細胞研究實驗室),siRNA〔美國Santa cruz公司 (sc-29410)〕,Lipofectamine RNAiMAX、Trizol試劑 (美國Invitrogen公司),iScriptTMcDNA合成試劑盒 (BIORAD公司),CXCL16 ELISA試劑盒 (美國R&D Systems公司),SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng) 將HUVEC復蘇后轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶,加入內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中,置于37℃、5%二氧化碳(CO2)條件下孵箱內(nèi)培養(yǎng),5~7 d傳代1次,采用0.25%胰蛋白酶消化細胞。

    1.2.2 實驗分組 分為4組:(1)對照組:正常內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)+siRNA陰性對照轉(zhuǎn)染;(2)缺血再灌注組:模擬缺血培養(yǎng)液培養(yǎng)30 min后換正常培養(yǎng)液再培養(yǎng)4 h+siRNA陰性對照轉(zhuǎn)染;(3)p65 siRNA轉(zhuǎn)染組:正常內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)+p65 siRNA轉(zhuǎn)染;(4)缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組:模擬缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染 (對HUVEC轉(zhuǎn)染p65 siRNA 48 h后再模擬缺血再灌注培養(yǎng))。

    1.3 模擬缺血再灌注培養(yǎng) 將HUVEC培養(yǎng)在包含118 mmol/L氯化鈉、24 mmol/L碳酸氫鈉、1.0 mmol/L磷酸鈉、2.5 mmol/L氯化鈣、1.2 mmol/L氯化鎂、20 mmol/L乳酸鈉、16 mmol/L氯化鉀、10 mmol/L 2-脫氧葡萄糖 (pH調(diào)至6.2)的“缺血液”中30 min,然后換為再灌注液即正常培養(yǎng)基進行“再灌注”4 h而實現(xiàn)。

    1.4 p65 siRNA轉(zhuǎn)染 預設(shè)計好并經(jīng)驗證的核因子κB p65特異性siRNA和不與人類任何編碼基因序列一致的對照siRNA均購自Santa cruz公司。將HUVEC接種于6孔板中,每孔2.0×105個細胞,使其在轉(zhuǎn)染細胞密度30% ~50%融合。于300μl的無血清、無抗生素Opti-MEM中稀釋3.6μl p65 siRNA,混勻。于300μl的無血清、無抗生素Opti-MEM中稀釋6μl轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAiMAX(終濃度為20 nmol/L),混勻。再將兩者混勻,常溫下孵育15 min,轉(zhuǎn)染48 h后檢測。收獲細胞前再根據(jù)實驗需要進行模擬“缺血再灌注”培養(yǎng)。

    1.5 核因子κB p65和CXCL16 mRNA實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng) (RT-PCR)檢測 用Trizol試劑盒抽提細胞總RNA。實時定量RT-PCR使用iScriptTMcDNA合成試劑盒。18 S rRNA作為內(nèi)對照。實時定量采用SYBR Premix Ex Taq和iQ5實時定量RT-PCR檢測系統(tǒng)(BioRad)。核因子 κB p65上游引物:5′-CCTGGAGCAGGCTATCAGTC-3′, 下 游 引 物:5′-ATCTTGAGCTCGGCAGTGTT-3′;CXCL16 上游引物:5′-AAGCTTCCATTCTTGGCTCA-3′, 下 游 引 物:5′-AAGCTTCCATTCTTGGCTCA-3′;18 S rRNA 上游引物:5′-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3′,下游引物:5′-GCTGGAATTACCGCGGCT-3′(引物均由北京三博遠志公司合成)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):mRNA樣品1μg,iScript逆轉(zhuǎn)錄酶1μl,5×iScript反應(yīng)混合物4μl,加無RNase的雙蒸水至20μl,輕輕振蕩混勻,25℃溫育5 min,42℃溫熱30 min,85℃加熱5 min。實時定量RT-PCR反應(yīng):cDNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2μl,上下游引物各 0.4μl,SYBR預混劑 10μl(寶生物 DRR041A),DEPC水(Sigma公司)7.2μl。反應(yīng)條件:第一步95℃ 30 s,第二步95℃ 5 s后62℃ 30 s,此步運行40個循環(huán),第三步55℃ 15 s,此步運行81個循環(huán)。每個樣本3孔,取3批實驗平均值。

    1.6 CXCL16的測定 收集各種實驗條件下培養(yǎng)HUVEC的上清液,以1 000 r/min離心5 min(離心半徑8 cm)后再取上清液于-80℃低溫凍存。應(yīng)用CXCL16檢測試劑盒,采用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中CXCL16表達水平,與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。經(jīng)過徹底洗滌后用底物3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的CXCL16呈正相關(guān)。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度 (OD值),計算樣品濃度。每個樣本3孔,獨立實驗3次取平均值。

    1.7 WST-1法檢測細胞存活率 HUVEC按 (7~8)×103/ml濃度接種到96孔板,200μl/孔。每種實驗條件設(shè)3孔,按上述實驗方法進行siRNA轉(zhuǎn)染和模擬缺血再灌注培養(yǎng)后,均更換正常培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后小心吸棄100μl上清液,加入10μlWST-1液,37℃孵育2 h,震蕩1 min,用全自動酶標儀,波長為450 nm,測定各孔OD值,記錄結(jié)果。整個實驗重復3次。細胞存活率= 〔(處理細胞OD值-本底OD值)/(對照細胞OD值-本底OD值)〕×100%。

    1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以 (±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較用LSD-t法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組核因子κB p65及CXCL16 mRNA相對表達量比較 對照組、缺血再灌注組、p65 siRNA轉(zhuǎn)染組及缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組核因子κB p65及CXCL16 mRNA相對表達量比較,差異均有統(tǒng)計學意義 (P<0.05);其中對照組、p65 siRNA轉(zhuǎn)染組及缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組核因子κB p65及CXCL16 mRNA相對表達量較缺血再灌注組均降低,差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05,見表1)。

    2.2 各組上清液CXCL16表達水平比較 對照組、缺血再灌注組、p65 siRNA轉(zhuǎn)染組及缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組CXCL16表達水平比較,差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05);其中對照組、p65 siRNA轉(zhuǎn)染組及缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組CXCL16表達水平較缺血再灌注組均降低,差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05,見表2)。

    表1 各組核因子κB p65和CXCL16 mRNA相對表達量比較(± s,n=16)Table 1 Comparison of relative expression quantity ofκB p65 and CXCL16 mRNA among various groups

    表1 各組核因子κB p65和CXCL16 mRNA相對表達量比較(± s,n=16)Table 1 Comparison of relative expression quantity ofκB p65 and CXCL16 mRNA among various groups

    注:與缺血再灌注組比較,*P<0.05

    組別 核因子κB p65 CXCL16對照組 0.14 ±0.29* 1.58 ±0.15*缺血再灌注組 0.69 ±0.21 3.33 ±0.30 p65 siRNA 轉(zhuǎn)染組 0.07 ±0.02* 1.69 ±0.21*缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組 0.18±0.03* 1.87±0.21*F 值0.001 0.001 14.896 69.629 P值

    表2 各組上清液CXCL16表達水平比較 ± s,ng/ml,n=16)Table 2 Comparison of supernatant CXCL16 expression levels among various groups

    表2 各組上清液CXCL16表達水平比較 ± s,ng/ml,n=16)Table 2 Comparison of supernatant CXCL16 expression levels among various groups

    注:與缺血再灌注組比較,*P<0.05

    組別CXCL16對照組 736±39*缺血再灌注組 1 510±68 p65 siRNA轉(zhuǎn)染組 632±45*缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組 547±32*F 值0.001 509.772 P值

    2.3 各組細胞存活率比較 各組實驗處理48 h后,WST-1法測定OD值計算細胞存活率。p65 siRNA轉(zhuǎn)染組及缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組細胞存活率較缺血再灌注組均增高,差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05,見表3)。

    3 討論

    趨化因子是一組具有趨化作用的細胞因子,CXCL16是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種清道夫受體,表達在血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和血管平滑肌細胞上。是繼CX3CL1之后發(fā)現(xiàn)的第二個能以膜結(jié)合形式和分泌型的可溶性分子存在的趨化因子。除了清道夫受體外,CXCL16還具有趨化激活T細胞、參與樹突細胞與T細胞的相互作用、促進細胞增殖和細胞-細胞間黏附等功能,近年來發(fā)現(xiàn)其在腫瘤[1-2]、動脈粥樣硬化[3]和缺血再灌注損傷[4]中可能起著重要的作用。

    表3 各組細胞存活率比較 (±s,%,n=16)Table 3 Comparison of cell survival rates among various cell groups

    表3 各組細胞存活率比較 (±s,%,n=16)Table 3 Comparison of cell survival rates among various cell groups

    注:與缺血再灌注組比較,*P<0.05

    組別 細胞存活率缺血再灌注組 55±6 p65 siRNA轉(zhuǎn)染組 89±10*缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組 70±9*F 值0.001 22.369 P值

    在小鼠肝損傷模型中,肝臟炎癥損傷組織中CXCL16表達水平增高,膜結(jié)合和分泌型CXCL16分別介導了對淋巴細胞的趨化和內(nèi)皮細胞的黏附[5]。而且,在該模型使用抗CXCL16抗體可顯著改善炎癥反應(yīng)、降低丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、減輕肝損傷,提示CXCL16在組織炎癥損傷中起重要作用。CXCR6是目前所知的CXCL16的惟一受體。CXCR6基因敲除小鼠較野生株有更強的抗缺血再灌注損傷作用,心肌梗死面積小,心功能相對好,反映了CXCL16/CXCR6信號級聯(lián)在缺血再灌注中的心臟保護作用[4]。本研究通過體外對HUVEC進行模擬缺血再灌注培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)模擬缺血再灌注培養(yǎng)能誘導CXCL16 mRNA表達水平上升。值得注意的是,本研究發(fā)現(xiàn)體外模擬缺血再灌注可刺激p65,p65是參與組成核因子κB的重要亞基,核因子κB是眾所周知的調(diào)控炎癥反應(yīng)的核心轉(zhuǎn)錄因子。本研究進一步采用siRNA方法來探索是否核因子κB p65參與了缺血再灌注刺激下對CXCL16表達水平的調(diào)節(jié)。RNA干擾 (RNAi)是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA介導的細胞內(nèi)某特定基因的mRNA發(fā)生特異性降解,從而導致靶基因的表達沉默,產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型抑制的現(xiàn)象。因為RNAi技術(shù)能高效、特異地使相應(yīng)基因失活,目前已作為一種簡單有效的替代基因敲除的有力工具[6]。本研究中通過siRNA沉默p65基因,特異性阻斷其分子生物學作用,導致缺血再灌注情況下CXCL16的表達受到抑制,提示核因子κB對CXCL16的調(diào)控作用。WST-1法顯示,模擬缺血再灌注不利于細胞生存,而選擇性沉默p65卻能顯著減少細胞死亡率,提示p65可能通過促炎反應(yīng)等一系列機制促進細胞在缺血再灌注中的損傷。Izquierdo等[7]報道核因子κB可介導CXCL16 mRNA轉(zhuǎn)錄增加促進急性腎損傷中的炎癥反應(yīng)。本研究顯示了模擬缺血再灌注情況下核因子κB介導CXCL16的表達增加,不利于細胞存活。CXCL16可能作為核因子κB的下游分子發(fā)揮作用,即核因子κB可以調(diào)節(jié)CXCL16促炎,反過來,CXCL16也可以通過核因子κB來發(fā)揮炎性效應(yīng)。例如,CXCL16經(jīng)由細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 (ERK)/IκB激酶/IκB途徑活化核因子κB,誘導腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達促進炎癥反應(yīng)、加重細胞和組織損傷[8]。此外,CXCL16還可通過Akt/蛋白激酶B(PKB)間接調(diào)節(jié)核因子 κB活化[9]。

    總之,使用siRNA下調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細胞p65的表達,可抑制模擬缺血再灌注誘導的內(nèi)皮細胞CXCL16的表達,促進細胞存活。CXCL16參與缺血再灌注損傷的細胞信號轉(zhuǎn)導途徑十分復雜,其具體機制尚有待于進一步深入研究。

    本課題人員貢獻:曾敏負責文章書寫及部分實驗操作;魏欣負責文章修改及部分實驗操作;李偉、符秀虹、蒙緒卿負責實驗指導及部分實驗操作;陳積雄、王萍負責實驗操作。

    本研究創(chuàng)新之處:本研究探討核因子 κB、CXCL16促進炎癥反應(yīng)導致缺血再灌注損傷的分子機制,顯示了對人臍靜脈內(nèi)皮細胞進行模擬缺血再灌注培養(yǎng)能誘導CXCL16 mRNA的表達水平;此外,在模擬缺血再灌注中,CXCL16作為核因子κB的下游分子而發(fā)揮作用。

    1 Lee JT,Lee SD,Lee JZ,et al.Expression analysis and clinical significance of CXCL16/CXCR6 in patientswith bladder cancer[J].Oncol Lett,2013,5(1):229-235.

    2 Deng L,Chen N,LiY,etal.CXCR6/CXCL16 functions as a regulator inmetastasis and progression of cancer [J].Biochim Biophys Acta,2010,1806(1):42-49.

    3 Lv Y,Hou X,Ti Y,et al.Associations of CXCL16/CXCR6 with carotid atherosclerosis in patients withmetabolic syndrome[J].Clin Nutr,2013,32(5):849-854.

    4 Zhao G,Wang S,Wang Z,etal.CXCR6 deficiency amelioratedmyocardial ischemia/reperfusion injury by inhibiting infiltration ofmonocytes and IFN-gamma-dependent autophagy [J].Int J Cardiol,2013,168(2):853-862.

    5 Xu HB,Gong YP,Jiang ZG,et al.The role of CXCL16 in immunological liver injury induced by BCG and LPS in mice[J].Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi,2005,13(4):282-285.

    6 Gottumukkala SN,Dwarakanath CD,Sudarsan S.Ribonucleic acid interference induced gene knockdown [J].J Indian Soc Periodontol,2013,17(4):417-422.

    7 Izquierdo MC,Sanz AB,Sánchez-Ni?o MD,et al.Acute kidney injury transcriptomics unveils a relationship between inflammation and ageing [J].Nefrologia,2012,32(6):715-723.

    8 Chen T,Guo ZP,Jiao XY,et al.Peoniflorin suppresses tumor necrosis factor-alpha induced chemokine production in human dermalmicrovascular endothelial cells by blocking nuclear factor-κB and ERK pathway [J].Arch Dermatol Res,2011,303(5):351-360.

    9 Chandrasekar B,Bysani S,Mummidi S.CXCL16 signals via Gi,phosphatidylinositol3-kinase,Akt,I kappa B kinase,and nuclear factor-kappa B and induces cell-cell adhesion and aortic smoothmuscle cell proliferation [J].JBiol Chem,2004,279(5):3188-3196.

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