小干擾RNA對(duì)椎間盤炎癥大鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的影響研究

王 剛

椎間盤源性腰痛(discogenic low back pain，DLBP)為現(xiàn)代骨科醫(yī)學(xué)的研究難點(diǎn)和熱點(diǎn)，其病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚未明確，臨床上缺乏特異的治療方法[1]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，隨著人們現(xiàn)代社會(huì)生活節(jié)奏的加快和工作強(qiáng)度的提升，DLBP發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[2-3]。電生理學(xué)研究表明，機(jī)體在正常生理狀態(tài)下，神經(jīng)纖維僅存在于椎間盤纖維環(huán)外層，而DLBP患者的纖維環(huán)內(nèi)層乃至髓核內(nèi)部均可見神經(jīng)纖維分布，提示神經(jīng)纖維長(zhǎng)入可能為DLBP的重要發(fā)病機(jī)制[4-5]，為其臨床治療方向由宏觀行為學(xué)向分子生物學(xué)轉(zhuǎn)變提供了新的理論支撐。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)過表達(dá)和炎性因子過分泌是DLBP發(fā)病機(jī)制中的研究熱點(diǎn)[6-7]。本研究以椎間盤炎癥大鼠為動(dòng)物模型，旨在探討小干擾RNA(siRNA)對(duì)NGF的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，雌雄各半；體質(zhì)量180～240 g，平均(223.0±12.4)g；月齡2.5～3.5個(gè)月，平均(2.9±0.7)個(gè)月；購(gòu)于中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，批號(hào)：SYXK(粵)2007-0081。

1.2 主要儀器與試劑 主要儀器：PCR儀(C1000 Thermal cycler，BIO-RAD)，熒光定量?jī)x(IQ5，BIO-RAD)，制冰機(jī)(AF100，Scotsman)，低溫超速離心機(jī)(Scanspeed 1730，Labogene)，微型振蕩器(QL-901，海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)，流式細(xì)胞儀(EPICS? ALTRATM，Beckman)等。主要試劑：LipofectamineTM2000(Inbitrogen)，Trizol總RNA提取試劑盒(Inbitrogen)，NGF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定試劑盒(Chemicon)，Oligo dT Primer、Random Primer、5×PrimeScriptTMBuffer等PCR試劑均由TAKARA公司提供；其他試劑如乙醇、氯仿等為國(guó)產(chǎn)分析純；IL-6、IL-1β試劑盒購(gòu)于Peprotechec公司；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于Gibco公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞體外培養(yǎng) 細(xì)胞體外培養(yǎng)方法參照參考文獻(xiàn)[8]。(1)手術(shù)分離60只大鼠椎間盤髓核及纖維環(huán)細(xì)胞：取出椎間盤組織后立即用冰磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，分離髓核組織并在DMEM/F12培養(yǎng)基中剪碎，離心半徑15 cm，4 000 r/min，4 ℃離心5 min后重懸，37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng) 8 h；離心半徑15 cm，4 000 r/min，4 ℃離心5 min去上清液，PBS漂洗后，依次用0.25%胰蛋白酶、2%Ⅱ型膠原酶消化，離心半徑15 cm，4 000 r/min，4 ℃離心5 min去上清液；再用DMEM/F12重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，確定細(xì)胞數(shù)可達(dá)104/L以上，并調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)為1×104/L，轉(zhuǎn)移到37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)細(xì)胞培養(yǎng) 7 d后，以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。將大鼠分為對(duì)照組(n=12)和實(shí)驗(yàn)組(n=48)，對(duì)照組在含0.3%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組中分別加入10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L的IL-6、IL-1β培養(yǎng)48 h，每個(gè)亞組12只。

1.3.2 NGF-siRNA的導(dǎo)入和鑒定 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2.5×106/ml；根據(jù)說明書，將焦碳酸二乙酯(DEPC) H2O和LipofectamineTM2000按比例稀釋后與NGF-siRNA混勻，孵育10 min，等比例(2.5×105/孔)加入6孔板中，輕搖混勻；37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，及時(shí)換液。導(dǎo)入NGF-siRNA前后以流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，計(jì)算NGF-siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。

1.3.3 NGF mRNA相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定 NGF mRNA的實(shí)時(shí)Q-PCR引物序列：上游引物為5′-ACTTCAGCATTCCCTTGACACA-3′，下游引物為5′-ACGGGCAGCTATTGGTTCAG-3′，Probe為5′-FAM-CCCTCCGCAGAGCCCGCA-TAMRA-3′；以GAPDH為內(nèi)參基因，引物序列：上游引物為5′-AGGGCTGCCTTCTCTTGTGA-3′，下游引物為5′-AACTTGCCGTGGGTAGAGTCA-3′，Probe為5′-FAM-CCATCAACGACCCCTTCATTGACCTC-TAMRA-3′。逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增均由PCR儀自動(dòng)完成，采用常規(guī)體系進(jìn)行配比，反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄：7 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s；擴(kuò)增：93 ℃ 2 min；93 ℃ 15 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

Ct值(拷貝數(shù)/μl cDNA)為熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定域值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，每個(gè)模板的Ct值與該模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，即起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小?？紤]到各樣本總RNA濃度的差異，NGF mRNA相對(duì)表達(dá)量=Ct目的基因/Ct內(nèi)參基因。

1.3.4 NGF細(xì)胞液濃度的測(cè)定 收集細(xì)胞培養(yǎng)液100 μl，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作測(cè)定細(xì)胞液NGF濃度。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞鑒定 (1)甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示，髓核細(xì)胞染色呈強(qiáng)陽性(見圖1A)；纖維環(huán)細(xì)胞染色胞核為紫色，胞質(zhì)為深藍(lán)色，細(xì)胞多呈梭形，胞質(zhì)內(nèi)可見較多空泡(見圖1B)。(2)番紅O染色結(jié)果顯示，髓核細(xì)胞染色呈陽性，胞質(zhì)為粉紅色，核周可見棕紅色顆粒狀物質(zhì)(見圖2A)；纖維環(huán)細(xì)胞著色較淺(見圖2B)。細(xì)胞體外培養(yǎng)成功，順利取得椎間盤髓核細(xì)胞及纖維環(huán)細(xì)胞。

注：A為髓核細(xì)胞，B為纖維環(huán)細(xì)胞

圖1 大鼠椎間盤髓核細(xì)胞及纖維環(huán)細(xì)胞染色結(jié)果(甲苯胺藍(lán)染色，×200)

Figure1 Dyeing appraisal results of intervertebral disc nucleus pulposus cells and annulus fibrosus cells of rats

注：A為髓核細(xì)胞，B為纖維環(huán)細(xì)胞

圖2 大鼠椎間盤髓核細(xì)胞及纖維環(huán)細(xì)胞染色結(jié)果(番紅O染色，×200)

Figure2 Dyeing appraisal results of intervertebral disc nucleus pulposus cells and annulus fibrosus cells of rats

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)化率 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，NGF-siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)化率為99.8%(見圖3)。

2.3 NGF mRNA相對(duì)表達(dá)量 GAPDH和NFG mRNA標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線平行性良好，曲面光滑，擴(kuò)增條件準(zhǔn)確、特異度高(見圖4A、4B)；GAPDH和NFG mRNA標(biāo)準(zhǔn)直線回歸圖顯示兩者回歸性良好，回歸系數(shù)R2均>0.99，具有較高重現(xiàn)性(見圖4C、4D)。導(dǎo)入NGF-siRNA前，10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L組NGF mRNA相對(duì)表達(dá)量均較對(duì)照組上調(diào)，分別上調(diào)3.4、3.7、4.7、8.0倍(P<0.05)；導(dǎo)入NGF-siRNA后，各組NGF mRNA相對(duì)表達(dá)量均較導(dǎo)入前下調(diào)，分別下調(diào)39.5%、45.5%、45.3%、39.9%、47.8%(P<0.05，見圖4E、4F，表1)。

2.4 細(xì)胞液NGF濃度 導(dǎo)入NGF-siRNA前，10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L組細(xì)胞液NGF濃度均較對(duì)照組升高，分別升高2.9、3.3、4.5、7.4倍(P<0.05)；導(dǎo)入NGF-siRNA后，各組細(xì)胞液NGF濃度均較導(dǎo)入前降低，分別降低47.2%、33.8%、35.4%、43.0%、54.9%(P<0.05，見表2)。

注：A為導(dǎo)入NGF-siRNA前，B為導(dǎo)入NGF-siRNA后

圖3 導(dǎo)入NGF-siRNA前后流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

Figure3 Flow cytometry results of cultured cells before and after NGF-siRNA interference

Table1 Comparison of NGF mRNA expression before and after NGF-siRNA interference

時(shí)間對(duì)照組10nmol/L組20nmol/L組50nmol/L組100nmol/L組F值P值導(dǎo)入前0114±00210388±0032?0422±0037?0536±0041?0912±0064?77140000導(dǎo)入后0069±00140224±0017?0231±0024?0322±0031?0476±0039?41210007差值0045±00130164±0016 0191±0021 0214±0027 0436±0041 t值26442214238423192654P值00120023001700180011

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

Table2 Comparison of NGF levels before and after NGF-siRNA interference

時(shí)間對(duì)照組10nmol/L組20nmol/L組50nmol/L組100nmol/L組F值P值導(dǎo)入前214±236621±113?706±147?963±214?1580±334?11240000導(dǎo)入后113±203411±213?456±227?549±247? 713±316? 67740000差值101±194210±162 251±164 414±173 867±334 t值24532382231525142653P值00140017001900130011

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

注：A和B分別為GAPDH和NFG mRNA標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線；C和D分別為GAPDH和NFG mRNA標(biāo)準(zhǔn)直線回歸圖；E和F分別為GAPDH和NFG mRNA樣本擴(kuò)增曲線

圖4 GAPDH和NFG mRNA的Q-PCR結(jié)果

Figure4 Q-PCR assay results of GAPDH and NFG mRNA

3 討論

DLBP又稱椎間盤內(nèi)紊亂，為漸進(jìn)性退變，病變部位不僅局限于發(fā)病椎體自身，且隨著病情進(jìn)展，鄰近節(jié)段均可出現(xiàn)受累，最終可累及整個(gè)椎骨體系[9-10]。從形態(tài)病理學(xué)而言，DLBP患者多存在椎間盤纖維環(huán)和髓核裂隙、破損及骨密度降低，導(dǎo)致患者脊柱生理曲度異常，運(yùn)動(dòng)節(jié)段機(jī)械力學(xué)失穩(wěn)和神經(jīng)機(jī)械性損傷；從神經(jīng)病理學(xué)而言，DLBP患者神經(jīng)纖維分布密度增加，疼痛感受器閾值較低，存在廣泛的痛敏反應(yīng)；從生物病理學(xué)而言，DLBP患者的機(jī)械損傷和痛敏反應(yīng)以炎性反應(yīng)為媒介，相輔相成，互為因果。

既往研究表明，椎間盤損傷過程中涉及腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-1β、IL-6等大量炎性遞質(zhì)的介導(dǎo)和參與，且其椎間濃度變化在發(fā)病急性期表現(xiàn)最為突出[11-12]，提示炎性遞質(zhì)為DLBP病情加重的重要誘因，但其具體機(jī)制尚未完全明確。本研究以炎性椎間盤細(xì)胞為靶細(xì)胞，進(jìn)行IL-1β及IL-6干預(yù)實(shí)驗(yàn)；結(jié)果顯示，10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L組NGF mRNA相對(duì)表達(dá)量均較對(duì)照組上調(diào)，細(xì)胞液NGF濃度均較對(duì)照組升高，且NGF mRNA相對(duì)表達(dá)量上調(diào)幅度及細(xì)胞液NGF濃度升高幅度與IL-1β及IL-6呈劑量依賴性，即隨著IL-1β及IL-6濃度增加，NGF mRNA相對(duì)表達(dá)量上調(diào)幅度及細(xì)胞液NGF濃度升高幅度增大，提示炎性因子IL-1β及IL-6的分泌為誘導(dǎo)大鼠椎間盤NGF表達(dá)的重要誘因。

NGF為自體神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)供給的基礎(chǔ)成分之一，可參與神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、修復(fù)、再生等多項(xiàng)基本生理功能，在大鼠胚胎椎間盤中分部廣泛，用以維持脊髓神經(jīng)細(xì)胞分化和增殖[13]；而在健康成鼠中，NGF多見于椎間盤纖維環(huán)外緣，髓核濃度甚微。NGF異常高表達(dá)可能與受損神經(jīng)細(xì)胞的自我修復(fù)過程的啟動(dòng)密切相關(guān)，為近年骨與神經(jīng)外科損傷的研究熱點(diǎn)[14]。Fire等[15]研究認(rèn)為，NGF異常高表達(dá)為DLBP神經(jīng)長(zhǎng)入的主要微觀病理機(jī)制，且DLBP炎性疼痛的信號(hào)傳導(dǎo)以NGF依賴性神經(jīng)元為主要媒介，提示NGF不僅誘導(dǎo)了DLBP的神經(jīng)長(zhǎng)入，還參與了其炎性疼痛的致敏效應(yīng)。推測(cè)炎性遞質(zhì)IL-1β及IL-6誘導(dǎo)的NGF異常高表達(dá)為椎間盤損傷的重要機(jī)制之一。因此，本研究以siRNA干擾技術(shù)對(duì)IL-1β及IL-6誘導(dǎo)的NGF異常高表達(dá)進(jìn)行抑制，結(jié)果顯示，導(dǎo)入NGF-siRNA后，各組NGF mRNA相對(duì)表達(dá)量及細(xì)胞液NGF濃度均較導(dǎo)入前下調(diào)及降低，提示NGF-siRNA能夠抑制炎性因子IL-6及IL-1β對(duì)椎間盤細(xì)胞NGF的誘導(dǎo)效應(yīng)，為DLBP的治療提供了新靶點(diǎn)。

總之，本研究在體外細(xì)胞水平證實(shí)了炎性因子IL-6及IL-1β誘導(dǎo)DLBP的可能機(jī)制，為NGF-siRNA治療DLBP的可行性提供了重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。但本研究以大鼠椎間盤體外培養(yǎng)細(xì)胞為載體，也存在一定的局限性：(1)大鼠模型制備采用的是弗氏佐劑，其基本原理為直接刺激結(jié)核桿菌致關(guān)節(jié)炎抗原，即65 kD的熱休克蛋白(HSP)，進(jìn)而激發(fā)炎性反應(yīng)，其致炎時(shí)限一般為10～20 d，20 d可達(dá)高峰，而真正的DLBP發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多數(shù)患者屬長(zhǎng)期、慢性病變，因此，弗氏佐劑制備的椎間盤炎性模型僅能夠模擬DLBP的部分炎性反應(yīng)，在模型制備上，尚需完善和改進(jìn)；(2)本研究為體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，雖證實(shí)NGF-siRNA干擾治療DLBP有一定作用，但尚需進(jìn)行更多的體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證療效，這也是下一步研究的重點(diǎn)。

1 湯冀強(qiáng)，黃慶森.椎間盤源性腰痛的診療進(jìn)展[J].中國(guó)矯形外科雜志，2009，17(17)：1307-1310.

2 王輝輝.椎間盤源性腰痛的診斷進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2012，9(6)：205-208.

3 Hurri H，Karppinen J.Discogenic pain[J].Pain，2004，112(3)： 225-228.

4 Aoki Y，Takahashi Y，Ohtori S，et al.Distribution and immunocytochemical characterization of dorsal root ganglion neurons innervating the lumbar intervertebral disc in rats：a review[J].Life Sci，2004，74(2)：2627-2642.

5 關(guān)圓，倪家驤.椎間盤源性腰痛的細(xì)胞病理學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2012，27(7)：683-686.

6 Ozawa T，Ohtori S，Inoue G，et al.The degenerated lumbar intervertebral disc is innervated primarily by peptide-containing sensory nerve fibers in humans[J].Spine(Phila Pa 1976)，2006，31(21)：2418-2422.

7 Kakutani K，Nishida K，Uno K，et al.Prolonged down regulation of specific gene expression in nucleus pulposus cell mediated by RNA interference in vitro[J].J Orthop Res，2006，24(6)：1271-1278.

8 王剛，韓敦富，施彥璋，等.IL-1β和IL-6對(duì)對(duì)椎間盤髓核細(xì)胞NGF表達(dá)的影響[J].中國(guó)病理生理雜志，2010，26(7)：1265-1269.

9 Freemont AJ，Peacock TE，Goupille P，et al.Nerve ingrowth into diseased intervertebral disc in chronic back pain[J].Lancet，1997，350(9072)：178-181.

10 Coppes MH，Marani E，Thomeer RT，et al.Innervation of "painful" lumbar discs[J].Spine(Phila Pa 1976)，1997，22(20)： 2342-2349；discussion 2349-2350.

11 王剛，劉尚禮，程志安，等.椎間盤切除術(shù)對(duì)腰椎間盤突出癥腰痛的影響[J].中國(guó)矯形外科雜志，2009，17(6)：23-26.

12 Roberts S，Eisenstain SM，Menage Y，et al.Mechanoreceptors in intervertebral discs.Morphology，distribution and neuropeptides[J].Spine(Phila Pa 1976)，1995，20(24)：2645-2651.

13 Abe Y，Akeda K，Masuda K，et al.Proinflammatory cytokines stimulate the expression of nerve growth factor by human intervertebral disc cells[J].Spine(Phila Pa 1976)，2007，32(6)：635-642.

14 Han D，Ding Y，Liu SL，et al.Double role of Fas ligand in the apoptosis of intervertebral disc cells in vitro[J].Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)，2009，41(11)： 938-947.

15 Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature，1998，391(6669)：806-811.