戊四氮誘導(dǎo)大鼠癲癇模型中前腦磷酸化DARPP-32與嗜酸損傷神經(jīng)元的相關(guān)性研究

王偉文，廖曉陽，楊正輝，林 航，王慶松，吳俞憲，劉 榆

Dazzi等[1]研究報(bào)道，在重復(fù)系統(tǒng)給予亞驚厥劑量戊四氮(PTZ)誘發(fā)的癲癇模型中，位于前腦皮質(zhì)、伏隔核及紋狀體等區(qū)域的細(xì)胞外多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)水平明顯升高，并且這種內(nèi)源性多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的升高與中樞神經(jīng)元的興奮毒性有關(guān)[2]。DARPP-32(dopamine and adenosine 3′5′-monophosphate-regulated phospho-protein,Mr 32 kD)是多巴胺下游作用的一個(gè)重要分子靶點(diǎn)，主要分布于含有D1受體的神經(jīng)元上，磷酸化DARPP-32(p-DARPP-32)在多巴胺調(diào)解包括N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)、γ-氨基丁酸(GABA)等各類興奮或抑制性神經(jīng)遞質(zhì)生物學(xué)效應(yīng)方面扮演著中心角色[3-4]。那么，p-DARPP-32在PTZ誘發(fā)的癲癇模型中是否介入了癲癇所致的神經(jīng)元損傷是本研究所探討的問題。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫酶組織化學(xué)及蘇木素-伊紅染色法研究PTZ誘導(dǎo)的全面性癲癇大發(fā)作后DARPP-32在大鼠前腦的磷酸化表達(dá)分布情況及其時(shí)程變化與嗜酸損傷神經(jīng)元時(shí)程變化之間的可能聯(lián)系，以探討p-DARPP-32在實(shí)驗(yàn)性大鼠癲癇模型中存在的神經(jīng)元損傷所扮演的角色。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠35只, 體質(zhì)量210～230 g(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),置于溫暖(20 ℃)、安靜環(huán)境中飼養(yǎng)48 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與模型制備

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組(n=5)和1個(gè)對(duì)照組(n=10):(1) A組：PTZ 1 h,大鼠在PTZ誘發(fā)癲癇發(fā)作1 h后被處死，后幾組按相應(yīng)的時(shí)間處死；(2) B組：PTZ 6 h；(3) C組：PTZ 24 h；(4)D組：PTZ 48 h；(5)E組：PTZ 72 h；(6)對(duì)照組大鼠接受同樣體積和次數(shù)的0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，而后在與上述各組相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)被處死，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)2只大鼠。

本文創(chuàng)新點(diǎn)

盡管實(shí)驗(yàn)動(dòng)物癲癇模型中將嗜酸神經(jīng)元作為觀察腦神經(jīng)元凋亡、壞死指標(biāo)的文獻(xiàn)報(bào)道很多，但在重復(fù)系統(tǒng)給予亞驚厥劑量的戊四氮(PTZ)誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)模型中有關(guān)嗜酸神經(jīng)元數(shù)量在前腦時(shí)程變化的文獻(xiàn)報(bào)道較少。DARPP-32是多巴胺下游作用的一個(gè)重要分子靶點(diǎn)，磷酸化DARPP-32(p-DARPP-32)在多巴胺調(diào)解包括N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)、γ-氨基丁酸(GABA)等各類興奮或抑制性神經(jīng)遞質(zhì)生物學(xué)效應(yīng)方面扮演著核心角色。而有關(guān)DARPP-32在癲癇動(dòng)物模型中前腦的磷酸化表達(dá)更是少有報(bào)道，本研究即通過對(duì)PTZ誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)模型中p-DARPP-32在大鼠前腦的表達(dá)分布及時(shí)程變化狀況來推測(cè)DARPP-32可能參與了癲癇模型病理生理的調(diào)控。通過對(duì)該癲癇模型中p-DARPP-32時(shí)程變化與嗜酸損傷神經(jīng)元時(shí)程變化之間存在的同步正相關(guān)分析以間接證明p-DARPP-32在該模型所致的神經(jīng)元損傷中發(fā)揮著作用。

1.2.2 模型制備 各實(shí)驗(yàn)組大鼠均接受重復(fù)低劑量PTZ腹腔注射以最終達(dá)到全身性癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)。重復(fù)PTZ腹腔注射方案：首劑給予20 mg/kg PTZ，然后每間隔10 min腹腔注射10 mg/kg PTZ直至SE發(fā)作。SE發(fā)作的特征是：大鼠出現(xiàn)連續(xù)的跌倒強(qiáng)直發(fā)作期(10～15 s)，而后反復(fù)出現(xiàn)幾分鐘的頭和肢體的陣攣性發(fā)作[5]。大鼠在SE發(fā)作后被放回溫暖(20 ℃)、安靜環(huán)境中飼養(yǎng)，分別在相應(yīng)的時(shí)間被處死[6]。

1.3 切片制備 大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射深度系統(tǒng)麻醉后，予以左心室至升主動(dòng)脈插管，含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液(PBS，pH 7.4)灌流固定，冷凍切片機(jī)上行全腦組織連續(xù)冠狀切片，30 μm厚的組織切片被收集用于以后的免疫組織化學(xué)染色分析。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 各實(shí)驗(yàn)組全腦系列切片行免疫組織化學(xué)染色(ABC法)，首先一抗(兔抗p-DARPP-32, Cell Signaling, 1∶150) 4 ℃孵育48 h；其次二抗(驢抗兔生物素標(biāo)記的IgG，Check, 1∶400)室溫孵育4 h；最后ABC復(fù)合物(Vector, 1∶400)室溫下孵育2 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)棕色顯色，切片經(jīng)晾干、脫水、透明后封片。在Olympus BX-60顯微鏡下分析觀察結(jié)果，并采集圖像。對(duì)照實(shí)驗(yàn)中用正常兔血清替代一抗，余染色步驟同前。半定量分析位于大鼠皮質(zhì)、海馬和紋狀體區(qū)域SE發(fā)作后不同時(shí)段的p-DARPP-32陽性神經(jīng)元數(shù)量，每只大鼠每個(gè)區(qū)域挑選6～8張切片(雙側(cè))用以計(jì)數(shù)。

1.5 蘇木素-伊紅染色 各實(shí)驗(yàn)組經(jīng)全腦系列切片后進(jìn)行常規(guī)蘇木素-伊紅染色，顯示嗜酸損傷神經(jīng)元在大鼠皮質(zhì)、海馬及紋狀體區(qū)域的分布數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 不同組大鼠皮質(zhì)、海馬和紋狀體p-DARPP-32陽性神經(jīng)元數(shù)量比較 不同組大鼠皮質(zhì)、海馬和紋狀體p-DARPP-32陽性神經(jīng)元數(shù)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中與對(duì)照組比較，A組、B組、C組、D組、E組大鼠皮質(zhì)、海馬和紋狀體p-DARPP-32陽性神經(jīng)元數(shù)量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A組與B組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；C組較A組和B組均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D組和E組較C組均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D組與E組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

2.2 p-DARPP-32陽性神經(jīng)元在大鼠前腦的表達(dá)分布 PTZ誘發(fā)SE發(fā)作1 h后，p-DARPP-32陽性神經(jīng)元在大鼠前腦存在著廣泛的分布。在皮質(zhì)，p-DARPP-32陽性神經(jīng)元主要分布于Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ層，主要表達(dá)在胞質(zhì)、胞核上；在海馬，p-DARPP-32陽性神經(jīng)元在CA2、CA3區(qū)呈密集分布，而在CA1、CA4及齒狀回亞區(qū)也有散在的表達(dá)，且p-DARPP-32主要表達(dá)在胞質(zhì)及胞核上；在紋狀體，p-DARPP-32陽性神經(jīng)元主要分布在中間棘神經(jīng)元的胞質(zhì)和胞核中(見圖1)。

2.3 不同組大鼠皮質(zhì)、海馬和紋狀體嗜酸損傷神經(jīng)元數(shù)量比較 不同組大鼠皮質(zhì)、海馬和紋狀體嗜酸損傷神經(jīng)元數(shù)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中與對(duì)照組比較，A組、B組、C組、D組、E組大鼠皮質(zhì)、海馬和紋狀體嗜酸損傷神經(jīng)元數(shù)量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B組較A組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組較B組均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組、D組、E組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

Table1 Comparison of the number of p-DARPP-32 positive neurons in cortex, hippocampus and corpus striatum of different groups

組別只數(shù)皮質(zhì)海馬紋狀體對(duì)照組10194±54350±91430±134A組5420±106?1074±345?890±296?B組5397±113?1030±373?880±314?C組5330±74?△▲792±243?△▲673±217?△▲D組5277±77?☆670±191?☆500±157?☆E組5260±58?☆654±172?☆492±147?☆F值10093311477178952P值<0001<0001<0001

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與A組比較，△P<0.05；與B組比較，▲P<0.05；與C組比較，☆P<0.05

注：a(免疫組織化學(xué)，×40)、a′(免疫組織化學(xué)，×400)皮質(zhì)，b(免疫組織化學(xué)，×40)、b′(免疫組織化學(xué)，×400)海馬, c(免疫組織化學(xué)，×40)、c′(免疫組織化學(xué)，×400)紋狀體

圖1 PTZ誘導(dǎo)SE發(fā)作1 h后，p-DARPP-32陽性神經(jīng)元在皮質(zhì)、海馬及紋狀體區(qū)域的分布

Figure1 Distribution of p-DARPP-32 positive neurons in cortex, hippocampus and corpus striatum one hour after the onset of SE induced by PTZ

Table2 Comparison of the number of acidophilic neurons in cortex, hippocampus and corpus striatum of different groups

組別只數(shù)皮質(zhì)海馬紋狀體對(duì)照組10060±041020±004134±037A組5280±138?048±009?580±201?B組5461±200?△178±048?△1344±483?△C組5870±283?▲389±087?▲1780±681?▲D組51074±431?397±084?2000±502?E組5922±378?401±113?1970±511?F值203628648593298800P值<0001<0001<0001

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與A組比較，△P<0.05；與B組比較，▲P<0.05

2.4 光鏡下?lián)p傷神經(jīng)元的病理特征 PTZ誘導(dǎo)SE發(fā)作后，嗜酸損傷神經(jīng)元在包括皮質(zhì)、海馬及紋狀體在內(nèi)的前腦區(qū)域均可觀察到。嗜酸損傷神經(jīng)元均顯示出細(xì)胞核固縮及胞體形狀不規(guī)則，胞質(zhì)、胞核呈伊紅著色，部分區(qū)域尚有炎性細(xì)胞浸潤(見圖2)。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，PTZ誘導(dǎo)SE發(fā)作后p-DARPP-32在大鼠前腦皮質(zhì)、海馬及紋狀體均存在著明顯表達(dá)，且主要表達(dá)在神經(jīng)元的胞質(zhì)、胞核上，其總體分布與DARPP-32在前腦的分布相重疊[7]。且p-DARPP-32的表達(dá)存在著一個(gè)時(shí)程變化，即發(fā)作1 h、6 h后p-DARPP-32在前腦神經(jīng)元的表達(dá)達(dá)到了高峰，24 h后開始逐漸下降。同樣，嗜酸損傷神經(jīng)元數(shù)量也存在著時(shí)程變化，即SE發(fā)作后嗜酸損傷神經(jīng)元數(shù)量在相同時(shí)點(diǎn)開始逐漸升高，其上升趨勢(shì)在發(fā)作24 h后才逐漸停止。SE發(fā)作24 h內(nèi)p-DARPP-32與嗜酸損傷神經(jīng)元數(shù)量同步增長；24 h后p-DARPP-32表達(dá)的水平下降時(shí)，嗜酸神經(jīng)元數(shù)目的增加也趨于平緩。

癲癇是一種因大腦半球局部神經(jīng)元電活動(dòng)過度活躍所致的以臨床發(fā)作為特征的病理狀況。而癲癇持續(xù)狀態(tài)則常導(dǎo)致廣泛性的腦神經(jīng)元損傷。具體的損傷機(jī)制尚不清楚，部分原因可能與神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的鈣超載，最終導(dǎo)致細(xì)胞毒性損傷有關(guān)[8]。Fujikawa[9]應(yīng)用蘇木素-伊紅染色法來評(píng)價(jià)癲癇所致的急性神經(jīng)元損傷，認(rèn)為陽性嗜酸損傷神經(jīng)元在光鏡水平上可作為評(píng)價(jià)不可逆損傷神經(jīng)元的標(biāo)準(zhǔn)。并且，光鏡水平下腦的嗜酸細(xì)胞已經(jīng)被證明與電鏡下的細(xì)胞壞死密切關(guān)聯(lián)[10]。文獻(xiàn)中所描述的嗜酸損傷神經(jīng)元在光鏡下顯示為細(xì)胞核的固縮及胞核、胞質(zhì)伊紅著色，本實(shí)驗(yàn)中所觀察到的嗜酸損傷神經(jīng)元特征基本與之一致。SE發(fā)作1 h后，嗜酸神經(jīng)元數(shù)量在大鼠前腦開始逐漸升高，直至發(fā)作24 h后其上升趨勢(shì)才逐漸停止。癲癇發(fā)作后腦神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡、壞死在以往的文獻(xiàn)中多有報(bào)道[8]，但缺乏嗜酸損傷神經(jīng)元發(fā)生、發(fā)展變化時(shí)程的報(bào)告，尤其在PTZ誘導(dǎo)的SE模型中。

注：a對(duì)照組皮質(zhì)，a′ C組皮質(zhì)、b對(duì)照組海馬，b′ C組海馬，c對(duì)照組紋狀體，c′ C組紋狀體

圖2 PTZ誘導(dǎo)SE發(fā)作后嗜酸損傷神經(jīng)元在大鼠前腦區(qū)域的鏡下特征(蘇木素-伊紅染色，×400)

Figure2 Pathological features of acidophilic neurons in rat forebrain by light microscopy

以往PTZ誘導(dǎo)的癲癇模型中已有報(bào)道，位于前腦皮質(zhì)、紋狀體等區(qū)域的細(xì)胞外多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)水平明顯升高，且多巴胺水平的增加與所給PTZ劑量呈正性線性相關(guān)[1，7]。而DARPP-32是多巴胺下游作用的一個(gè)重要分子靶點(diǎn)，該模型中多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)可能通過激活D1/DARPP-32/PPI信息鏈導(dǎo)致DARPP-32磷酸化[11]。這從理論上解釋PTZ誘導(dǎo)的癲癇模型中DARPP-32存在著磷酸化變化。

另外，有趣的是嗜酸損傷神經(jīng)元數(shù)量逐漸增高的這一時(shí)程變化與p-DARPP-32表達(dá)的時(shí)程變化有一定的相關(guān)性。SE發(fā)作后24 h內(nèi)呈正相關(guān)，24 h后p-DARPP-32表達(dá)的水平開始下降，可能是DARPP-32的磷酸化表達(dá)已經(jīng)達(dá)到頂峰，并開始衰減。而嗜酸損傷神經(jīng)元數(shù)目的增加趨于平緩可能與p-DARPP-32的衰減有關(guān)，而本身存在的嗜酸損傷神經(jīng)元數(shù)目在一段時(shí)間內(nèi)不會(huì)減少或消失。Dazzi等[1]研究報(bào)道，在重復(fù)系統(tǒng)給予亞驚厥劑量PTZ誘發(fā)的癲癇模型中，位于前腦皮質(zhì)、伏隔核及紋狀體等區(qū)域的細(xì)胞外多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)水平明顯升高，并且這種內(nèi)源性多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的升高與中樞神經(jīng)元的興奮毒性有關(guān)[2]。DARPP-32是多巴胺下游作用的一個(gè)重要分子靶點(diǎn)，主要分布于含有D1受體的神經(jīng)元上，p-DARPP-32在多巴胺調(diào)解包括NMDA、GABA等各類興奮或抑制性神經(jīng)遞質(zhì)生物學(xué)效應(yīng)方面扮演著中心角色[3-4]。SE發(fā)作后細(xì)胞外多巴胺遞質(zhì)水平的升高可能最終通過激活多巴胺/D1/DARPP-32/PP-1信息鏈而使大鼠前腦神經(jīng)元上的DARPP-32磷酸化，繼而通過調(diào)節(jié)NMDA受體、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(AMPA受體)及左型Ca2+通道磷酸化的活性或提高這些離子通道介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高，而異常的Ca2+內(nèi)流在神經(jīng)元興奮毒方面起著重要作用[11-13]。上述理論預(yù)示了SE發(fā)作后p-DARPP-32表達(dá)與嗜酸損傷神經(jīng)元在大鼠前腦同步變化可能存在因果關(guān)系。因此，后期對(duì)模型中同步多巴胺水平的變化監(jiān)測(cè)及p-DARPP-32和凋亡神經(jīng)元的定量分析將進(jìn)一步闡明本研究結(jié)果。

綜上所述，在重復(fù)系統(tǒng)給予亞驚厥劑量PTZ誘發(fā)的癲癇模型中，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)p-DARPP-32在大鼠前腦的表達(dá)分布及其時(shí)程變化與嗜酸損傷神經(jīng)元數(shù)量時(shí)程變化的關(guān)系研究結(jié)果提示，SE發(fā)作后p-DARPP-32與嗜酸損傷神經(jīng)元數(shù)量的時(shí)程變化有著一定的同步相關(guān)性，即SE發(fā)作后同步上升，24 h后p-DARPP-32表達(dá)的水平下降，而嗜酸損傷神經(jīng)元數(shù)量的增加也趨于平緩。癲癇發(fā)作后，多巴胺激活D1/PKA/DARPP-32/PP-1信息鏈可能是導(dǎo)致大鼠前腦神經(jīng)元廣泛性損傷的重要原因之一，而p-DARPP-32在多巴胺發(fā)揮生理作用方面扮演著重要角色。

1 Dazzi L, Serra M, Porceddu ML, et al.Enhancement of basal and pentylenetetrazol(PTZ)-stimulated dopamine release in the brain of freely moving rats by PTZ-induced kindling[J].Synapse, 1997, 26(4):351-358.

2 Filloux F, Townsend JJ.Pre- and postsynaptic neurotoxic effects of dopamine demonstrated by intrastriatal injection[J].Exp Neurol, 1993, 119(1):79-88.

3 Greengard P,Nairn AC,Girault JA,et al.The DARPP-32/protein phosphatase-1 cascade:a model for signal integration[J].Brain Research Reviews,1998, 26(2/3):274-284.

4 Flores-Hernandez J,Hernandez S, Snyder GL, et al.D1 dopamine receptor activation reduces GABA(A) receptor currents in neostriatal neurons through a PKA/DARPP-32/PP1 signaling cascade[J].J Neurophysiol,2000, 83(5):2996-3004.

5 Nehlig A,Pereira de Vasconcelos A.The model of pentylentetrazol-induced status epilepticus in the immature rat:short- and long-term effects[J].Epilepsy Research, 1996, 26(1):93-103.

6 Gubits RM, Hazelton JL, Simantov R.Variations in c-fos gene expression during rat brain development[J].Brain Res, 1988,427(2):197-201.

7 Wang WW, Cao R, Chen LW, et al.Differetial expression of NMDA and AMPA receptor subunits in DARPP-32-containing neurons of the cerebral cortex, hippocampus and neostriatum of rats[J].Brain Research, 2004, 998(2):174-183.

8 Fujikawa DG, Zhao S, Ke X,et al.Mild as well as severe insults produce necrotic, not apoptotic, cells:evidence from 60-min seizures[J].Neurosci Lett, 2010, 469(3):333-337.

9 Fujikawa DG.The temporal evolution of neuronal damage from pilocarpine-induced status epilepticus[J].Brain Res, 1996, 725(1):11-22.

10 Ingvar M, Morgan PF, Auer RN.The nature and timing of excitotoxic neuronal necrosis in the cerebral cortex, hippocampus and thalamus due to flurothyl-induced status epilepticus[J].Aeta Neuropathol, 1988, 75(4):362-369.

11 Snyder GL, Fienberg AA, Huganir RL, et al.A dopamine/D1 receptor/protein kinase A/dopamine- and cAMP regulated phosphoprotein(Mr 32 kDa)/protein phosphatase-1 pathway regulates dephosphorylation of the NMDA receptor[J].J Neurosci,1998,18(24):10297-10303.

12 Sharopov S, Moser J, Chen R, et al.Dopaminergic modulation of low-Mg2+-induced epileptiform activity in the intact hippocampus of the newborn mouse in vitro[J].J Neurosci Res,2012,90(10):2020-2033.

13 Rocha L, Alonso-Vanegas M, Villeda-Hernández J, et al.Dopamine abnormalities in the neocortex of patients with temporal lobe epilepsy[J].Neurobiol Dis,2012,45(1):499-507.