胡黃連苷Ⅱ對過氧化氫誘導急性肝細胞損傷中Ⅱ相代謝酶mRNA表達的影響*

李白雪，馮全生△，張傳濤，吳 疆，范昕建

(1．成都中醫(yī)藥大學,成都 610075；2．成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,成都 610071)

氧化應激在肝細胞損傷的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，抗氧化治療對防治肝臟疾病有著重要的意義。核因子相關因子2(Nrf2)是一種氧化應激基本表達的關鍵轉錄因子，通過與抗氧化反應元件(antioxidant responsive element，ARE)結合，調(diào)控下游Ⅱ相代謝酶基因的轉錄活性，包括醌氧化還原酶(NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1，Nqo1)、谷胱甘肽-S-轉移酶(glutathione-S-transferase，GST)以及谷氨酸-半胱氨酸連接酶(glutamate-cysteine ligase,Gcl)，Gcl是谷胱甘肽(glutathione,GSH)合成的限速酶，其本身是由催化亞基(Gclc)和調(diào)節(jié)亞基(Gclm)2個亞單位構成，這一系列保護性蛋白能夠保護機體免受活性物質(ROS)及一些毒性物質(致癌物、藥物代謝活化產(chǎn)物)的侵害，同時在抗炎癥[1]、抗應激[2]、抗凋亡[3]以及神經(jīng)保護[4]等方面具有廣泛的細胞保護功能。Nrf2-ARE也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為重要的抵抗各種外環(huán)境應激和內(nèi)源性應激的通路。

胡黃連是傳統(tǒng)中藥，來源于玄參科植物黃連或西藏胡黃連的根莖，具有清濕熱、除骨蒸、消疳熱、利肝膽的作用，用于濕熱瀉痢、黃疸、痔疾、骨蒸潮熱、小兒疳熱等[5]?，F(xiàn)代中藥藥理表明，西藏胡黃連的主要含有環(huán)烯醚萜苷類、葫蘆素類、酚甙類三大類成分及少量的芳香酸和D-甘露醇，其中胡黃連環(huán)烯醚萜苷主要活性成分為胡黃連苷Ⅰ～Ⅲ(PicrosideⅠ～Ⅲ)，具有明顯保肝作用。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，胡黃連苷Ⅱ具有明顯的保肝作用，且與其抗氧化作用有關[6]。本實驗擬通過胡黃連苷Ⅱ作用于人肝細胞細胞株(L-02)，檢測肝細胞內(nèi)抗氧化通路Nrf2-ARE及下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶mRNA的變化，觀察胡黃連苷Ⅱ的保肝作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基(Gibco，Grand Island，NY，美國)，小牛血清(蘭州民海生物有限公司)，噻唑藍(MTT，sigma公司，美國),丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，RNA提取試劑盒( RNAiso plus，大連TaKaRa公司)，SYBR染料法實時熒光定量試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，大連TaKaRa公司)，逆轉錄試劑盒(EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix，北京全式金生物技術有限公司)，Nrf2、Gclc、Gclm、Nqo1、GST和GAPDH引物(上海生工生物工程技術服務有限公司)。倒置顯微鏡(CKX-31 Olympus，日本)，酶標儀(Bio-rad 550，美國)，PCR儀(Bio-rad iCycler，美國)，熒光定量 PCR儀(Bio-rad IQ5，美國)。

1.2 細胞培養(yǎng)

人肝細胞系L-02細胞株由四川大學華西醫(yī)院生物治療國家重點實驗室保種、傳代，細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱。

1.3 藥物制備

胡黃連苷Ⅱ標準品 (picroside Ⅱ,批號111596-200402)購于中國藥品生物制品檢定所；胡黃連苷Ⅱ用無血清培養(yǎng)液(DMEM)溶解，配制成5 mmol/L濃度的含藥培養(yǎng)液。

1.4 分組、造模及藥物處理[7]

將成對數(shù)成長期的L-02細胞接種于96孔板內(nèi)，接種密度為1×104個/孔，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜后，依據(jù)前期研究分別選用胡黃連苷Ⅱ(0、0.5、5 mmol/L)預處理3 h后[6]同時設對照組，除對照組外各組加入0.6 mmol/LH2O2作用1 h造成氧化損傷模型處理，繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h后進行相關檢測。

1.5 主要方法

1.5.1 MTT檢測細胞活力 細胞處理好之后，吸去含有藥物的培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含1 mg/mlMTT的細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h進行顯色反應，然后吸去培養(yǎng)液，每孔加入200 μL的二甲基亞砜(DMSO)，震蕩混勻后，用BIO-RAD550型酶標儀測定570nm處的光密度值(OD)，并依據(jù)OD值按公式計算細胞存活率：實驗組OD值/對照組OD值×100%(各組OD值均已減去空白調(diào)零孔OD值)。

1.5.2 ALT和AST檢測 收集各組細胞培養(yǎng)液，按ALT、AST測試盒(賴氏法)說明操作，以測定吸光度值，并查標準曲線得相應的AST/ALT單位。

1.5.3 qRT-PCR檢測 通過RNAiso plus提取細胞總RNA，利用EasyScript試劑盒逆轉錄得到cDNA。逆轉錄反應條件為25℃10 min、42℃30 min、75℃5 min。熒光定量PCR引物為： Nrf2 sense：5’- ACAATGAGGTTTCTTCGGCTAC-3’，anti-sense：5’- CGTCTAAATCAACAGGGGCTAC-3’；Gclc sense：5’-ATGGAGGTGCAATTAACAGAC-3’，anti-sense：5’-CTGCATTGCCACCTTTGCA-3’；Gclm sense：5’-GCTGTATCAGTGGGCACAG-3’， Anti-sense：5’-CGCTTGAATGTCAGGAATGC-3’；Nqo1 sense：5’-GGTTTGAGCGAGTGTTCATAGG-3’，anti-sense：5’-GCAGAGAGTACATGGAGCCAC-3’；GSTa4 Sense：5’-GAGAACCCTGATTGACATGTA-3’，Anti-sense：5’-GCTGATTACCAACAAGAAAGC-3’；GAPDH sense：5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGGA-3’，anti-sense：5’-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3’；熒光定量PCR反應體系(10 μL)為2×TaqPCR Master Mix 5 μL，上下引物(10 μmol/L)各0.25 μL，cDNA1 μL，雙蒸水補足至10 μL。反應條件為94℃5 min、94℃30 s、60℃30 s、72℃30 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，通過Gene Expression Divisio Outline軟件計算目的基因熒光實時定量PCR結果(Ct值)的相對表達量(以對照組相對表達量=1)。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 胡黃連苷Ⅱ對H2O2損傷L-02肝細胞MTT OD值的影響

表1 胡黃連苷Ⅱ對H2O2損傷L-02肝細胞MTT OD值的影響

注：與對照組比較：*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01；與0.5 mMpicⅡ+H2O2組比較：△P<0.05,△△P<0.01；與5 mMpicⅡ+H2O2組比較：□P<0.05,□□P<0.01

2.2 胡黃連苷Ⅱ對H2O2誘導L-02肝細胞損傷ALT和AST酶活性的影響

表2 胡黃連苷Ⅱ對H2O2誘導L-02肝細胞損傷的ALT和AST活性影響

注：與對照組比較：*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01；與0.5 mM picⅡ+0.6 mM H202組比較：△P<0.05，△△P<0.01； 與5 mMpicⅡ+H2O2組比較：□P<0.05,□□P<0.01

2.3 胡黃連苷Ⅱ干預對Nrf2及下游靶基因NQO1、Gclm、Gclc和GST mRNA表達水平的影響

圖1、2顯示，Real Time RT-PCR檢測結果顯示，胡黃連苷Ⅱ處理后，Nrf2及下游基因Gclc、Gclm、NQO1和GST表達顯著變化，均較模型組均增高(P<0.05)。同時胡黃連苷Ⅱ 高濃度處理組Gclm、NQO1和GSTmRNA表達較對照組增高(P<0.05)，并隨濃度升高呈上升趨勢，說明胡黃連苷Ⅱ對于Nrf2及下游抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶mRNA水平有上調(diào)作用。本實驗過程進行3次生物學重復，以GAPDH為內(nèi)參，通過Gene Expression Divisio Outline軟件計算目的基因熒光實時定量PCR結果(Ct值)的相對表達量(以對照組相對表達量=1)。

圖1 胡黃連苷Ⅱ對H2O2誘導氧化損傷肝細胞(L-02)Nrf2 mRNA表達的影響注：與模型組比較：* P<0.05,** P<0.01；與對照組比較：△P<0.05,△△ P<0.01；與0.5 mM pic+0.6 mM H2O2比較：□P<0.05, □□P<0.01；與5 mM pic+0.6 mM H202比較：#P<0.05, ##P<0.01

圖2 胡黃連苷Ⅱ對H2O2誘導氧化損傷肝細胞L-02的Gclc、Gclm、NQO1、GSTmRNA表達影響

圖3 Nrf2、Gclc、Gclm、NQO1、GST基因溶解曲線圖

3 討論

在肝細胞損傷過程中，氧自由基引起的氧化損傷，再加上炎癥反應起重要作用。氧化應激不僅是肝功能障礙的一部分，也是所有肝損傷的病理生理基礎。本實驗應用H2O2誘導肝細胞氧化損傷，H2O2可誘導L-02細胞發(fā)生氧化應激及細胞凋亡并可在細胞內(nèi)產(chǎn)生(OH·)，肝細胞在氧化應激作用下，細胞模型結構包括線粒體膜受到破壞，膜通透性增加，造成鈣超載[8]，肝細胞內(nèi)ALT與AST釋放增加。近年來研究發(fā)現(xiàn)，核因子 NF-E2 相關因子 ( nuclear fac-tor erythroid 2-related factor 2，Nrf2) 是 ARE 的激活因子。靜息狀態(tài)下，Nrf2與其胞漿抑制蛋白Kelch樣ECH相關蛋白1(Kelch-likeECH-associatedp-rotein1，Keap1)相結合，被泛素蛋白酶體途徑迅速降解，從而處于相對抑制狀態(tài)，當受到親電試劑或 ROS的刺激時，Nrf2從Keap1中解離，然后穩(wěn)定狀態(tài)的Nrf2轉移入核，與ARE的啟動子序列結合，調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和Ⅱ相代謝酶的表達，增強肝細胞的解毒及抗氧化能力[9]，對維持肝臟功能的穩(wěn)定以及阻止肝臟疾病的發(fā)生有重要的作用。Nrf2調(diào)控的代表性下游基因NQO1、GST和Gclc等，都是對抗應激反應和抗氧化損傷的重要組成部分[10]。

實驗表明，H2O2損傷導致肝細胞氧化損傷，肝細胞膜及線粒體膜破壞，通透性增高，以致細胞存活率下降，同時培養(yǎng)上清液中ALT、AST水平明顯升高，而經(jīng)胡黃連苷Ⅱ預處理各組細胞存活率增高，ALT、AST水平也較模型組明顯降低，提示肝細胞損傷程度較模型組輕，同時Nrf2及其下游Gclc、Gclm、NQO1和GST基因的mRNA表達較模型組升高，并隨藥物濃度升高呈上升趨勢，提示細胞抗氧化能力增強，而Nrf2模型組與對照組差異較小，考慮存在僅為Nrf2核轉位增加，而細胞內(nèi)總Nrf2含量不變，需檢測Nrf2胞漿胞核分布情況進一步闡明機制。通過激活Nrf2/ARE通路抵抗H2O2所致的L-02肝細胞氧化損傷，可能是胡黃連苷Ⅱ發(fā)揮抗氧化保肝作用的重要機制之一，同時為臨床該藥物的合理應用提供了實驗依據(jù)。

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