加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯抗腎臟纖維化的實(shí)驗(yàn)研究*

魏明剛，何偉明，劉 蔚，顧冬梅，李鳳玲，陸 迅，張新蘋，楊彥裕，孫 偉△

(1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，蘇州 215006； 2.江蘇省中醫(yī)院腎科，南京 210029)

由于各種病因?qū)е录?xì)胞外基質(zhì)(ECM) 在腎臟的異常積累和沉積可以誘發(fā)腎纖維化的發(fā)生和腎瘢痕形成[1，2],這是一個(gè)導(dǎo)致腎功能衰竭的主要病理變化。應(yīng)用阿霉素(ADR) 誘發(fā)的阿霉素腎病大鼠模型是公認(rèn)的慢性腎臟疾病病變模型之一。阿霉素誘導(dǎo)腎病模型與腎纖維化密切相關(guān),其病理改變包括腎小球硬化癥(GS)和腎間質(zhì)纖維化(RIF)[3]。腎纖維化相關(guān)腎病是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，其中涉及異常合成、分解代謝ECM和炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子(ICF)[4～6]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一個(gè)特定群體的鋅依賴性蛋白水解酶，負(fù)責(zé)細(xì)胞外基質(zhì)的代謝過程[4]。基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)是特定切斷基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制劑。最新的研究表明,基質(zhì)金屬蛋白酶尤其是MMP-9在腎臟的ECM代謝過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用[5～7]。另外，大量的蛋白尿可能是腎功能惡化和導(dǎo)致異常合成和分解代謝ECM和ICF的重要因素。本研究旨在控制或延緩ECM和ICF的病情，從而可能有利于緩解腎臟纖維化的進(jìn)展。在我們前面的相關(guān)研究工作基礎(chǔ)上[8],報(bào)道了QGYS可以同時(shí)減少阿霉素腎病大鼠的蛋白尿和尿NAG酶。而目前的研究旨在探索QGYS治療腎病的作用機(jī)制,特別是抗纖維化的效果和控制ECM的積聚。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

阿霉素購自浙江海正藥業(yè)有限公司，當(dāng)歸、黃芪和川芎等藥物購自蘇州天靈制藥有限公司，貝那普利(洛汀新?)購自諾華中國公司，所有其他用于研究的化學(xué)物質(zhì)和溶劑均為分析純。制備QGYS的方法。藥物按照一定的比例煎煮,然后將煎煮的藥液調(diào)整為最終濃度1 g/ml。

蛋白免疫印跡檢測系統(tǒng)由Amersham, Arlington Heights, IL公司提供，TIMP-1購自美國Chemicon有限公司，IV型膠原、纖連蛋白(FN)和兔抗鼠生物素化的二抗免疫球蛋白購自北京中山金橋公司，Trizol試劑購自美國GIBCO公司，辣根過氧化物酶(HRP)耦合的抗體,anti-β-tubulin單克隆抗體和二抗購自美國Santa Cruz公司，全自動生化儀來自O(shè)LYMPUS的AU-2700， 病理圖像分析系統(tǒng)來自德國的萊卡公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與方法

32只雄性SD大鼠體質(zhì)量(140±10 g)，購自從中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心(SCXK(上海市)2012-0002),并被安置在標(biāo)準(zhǔn)的溫度條件下(23±1℃)、相對濕度(55%±10%)和12 h光/12 h暗周期, 可以隨意獲取食物和水。老鼠按照按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照、模型、貝那普利和QGYS組4組,每組8只。除空白組老鼠外,其他組大鼠均給予阿霉素(7.5 mg/kg)通過尾靜脈注射。

大鼠灌胃治療包括清潔水、貝那普利或QGYS給予對應(yīng)組別的大鼠，治療時(shí)間為8周,每天1次。貝那普利和QGYS使用與人類等效劑量的藥物，分別是10 mg/kg/d(10 mg/kg/d)和1 g/kg/d(2 mg/kg/d)。QGYS的劑量也對應(yīng)于在我們的初步實(shí)驗(yàn)中抑制TGF-β1 mRNA的表達(dá)最低有效劑量。相對于貝那普利或QGYS治療組，模型組給予相同劑量的清潔水。在實(shí)驗(yàn)期間每2周對老鼠的體質(zhì)量稱重并記錄，在為期8周的實(shí)驗(yàn)時(shí)間結(jié)束時(shí)摘除腎臟。

1.3 尿液和血液檢測

實(shí)驗(yàn)大鼠在實(shí)驗(yàn)研究的第7、28、42、56天被置于代謝籠收集24 h尿液，在此期間并不改變大鼠的進(jìn)食和飲水習(xí)慣,收集尿液以便檢測24 h尿白蛋白排泄和尿NAG等項(xiàng)目。收集的尿液樣本(5 ml)是在室溫條件下離心機(jī)離心5 min收集上清液并儲存在-70℃超低溫冰箱直到測試。血液(3ml)的獲得方法主要是通過在實(shí)驗(yàn)研究的第7,28,42歲,56 d眼眶靜脈取血的方法,然后血液在室溫條件下離心10 min后收集血清并儲存在-70℃超低溫冰箱中以便測定血清白蛋白(SAL)、血清肌酐(SCr)和血液尿素氮(BUN)。生化指標(biāo)的檢測在自動生化分析儀上進(jìn)行，而尿液中如β2-microgloulin(β2-MG)和NAG酶等的檢測使用酶標(biāo)法測定。

1.4 腎臟樣品制備

大鼠脫頸椎處死亡后立即對兩側(cè)腎臟進(jìn)行移除，并除去腎臟外部的包膜，然后對腎臟稱重，進(jìn)行腎臟/身體(K/B)重量比的測定。腎臟使用冷生理鹽水清洗,然后使用濾紙擦干。腎臟皮質(zhì)小心從腎臟上取出并至少3次使用4℃冷鹽水溶液沖洗血液,然后從腎臟組織取出大約50 mg腎皮質(zhì)組織并在電子天平稱重，加入Trizol試劑立即冷凍和儲存在-70℃越低溫冰箱中以使后續(xù)RNA提取。

1.5 免疫組織化學(xué)分析

這個(gè)過程是應(yīng)用免疫組織化學(xué)中標(biāo)準(zhǔn)的SP染色方法。將腎組織樣本在10%中性甲醛中固定，酒精脫水后加入石蠟包埋。按照標(biāo)準(zhǔn)切片(4 μm)制備組織切片。切片放入抗原工作液中，5%～10%正常山羊血清封閉抗原，室溫孵育。4℃過夜后滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗。DAB染色、避光，隨時(shí)顯微鏡觀察，中性樹膠封片，光鏡下觀察。觀察方法：棕色或者棕褐色著色面積作為陽性面積。應(yīng)用計(jì)算機(jī)醫(yī)學(xué)病理圖像分析系統(tǒng)對腎臟組織切片的免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果進(jìn)行分析，在200倍光學(xué)顯微鏡下每個(gè)組織切片采集10個(gè)不重疊視野中的陽性染色面積，然后計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)染色區(qū)域的平均光密度數(shù)值，然后將數(shù)據(jù)匯總，應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析。

1.6 RT-PCR和免疫印跡分析

總RNA提取自腎臟皮質(zhì)使用一步法苯酚胍鹽異硫氰酸酯，過程使用Trizol試劑盒?？俁NA濃度測定吸光度在260 nm分光光度計(jì)，RT反應(yīng)和PCR反應(yīng)按照文獻(xiàn)的相關(guān)方法進(jìn)行[9]。

1.7 免疫印跡分析

免疫印跡方法按照文獻(xiàn)提供的方法進(jìn)行[10]。簡而言之,腎臟組織保存在體積為3 ml、濃度為10 μg/L的氯化鉀緩沖液(pH值7.7)中。然后應(yīng)用離心機(jī)持續(xù)離心15 min。取出上清液并收集蛋白提取物, 2 h在150 V12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，1 h在4℃ 100 V轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素。在4℃條件下膜被浸沒到三硼酸鹽水Tween-20(TBST-20)的緩沖液中過夜。然后膜使用TBST-20緩沖液反復(fù)清洗并使用辣根過氧化物酶(HRP)耦合的二抗孵化2 h。然后使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光工具包進(jìn)行分析，使用β-tubulin的表達(dá)作為內(nèi)參，使用anti-β-tubulin單克隆抗體(1∶1)及其二抗(山羊抗兔IgG-HRP 1∶5000)。為進(jìn)行蛋白的定量表達(dá),相對強(qiáng)度使用NIH在官方網(wǎng)站提供的圖像軟件進(jìn)行分析。特異性抗血清抗體通過吸收試驗(yàn)進(jìn)行確定。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 阿霉素腎病大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)

在實(shí)驗(yàn)過程中，對照組所有的老鼠存活并表現(xiàn)出正常的外表、行為與光滑的毛皮以及體質(zhì)量增加。相反,其他組的老鼠均表現(xiàn)出進(jìn)食下降和頭發(fā)光澤度下降、昏睡和缺乏活動,并有腹瀉和體質(zhì)量下降。

3.2 QGYS對腎身體/重量比、血清白蛋白和血脂的影響

表1顯示，模型組與對照組比較，血清白蛋白水均顯著下降，且差異早在造模第7天就已經(jīng)出現(xiàn)。使用貝那普利或QGYS治療可以部分恢復(fù)血清白蛋白水平，特別是56 d效果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組與對照組血脂水平比較明顯升高，應(yīng)用貝那普利或QGYS治療可以抑制高血脂水平，在實(shí)驗(yàn)的56 d具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。在實(shí)驗(yàn)的56天，模型組與對照組K/B質(zhì)量比比較可以看出明顯不同(3.46±0.19 vs 5.91±0.12)。貝那普利治療或QGYS可以明顯降低這個(gè)比率(4.85±0.19 vs 4.31±0.28),這種改變相對模型組組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。

表1 各組大鼠血清白蛋白和血脂的情況

3.3 QGYS 對24 h尿白蛋白和NAG酶的影響

圖1顯示，模型組大鼠與對照組比較24 h尿蛋白定量增加非常明顯。貝那普利和QGYS治療組尿蛋白的水平下降明顯。治療的證據(jù)表明，QGYS扭轉(zhuǎn)了尿蛋白增加的趨勢，與模型組比較尿蛋白減少超過50%左右，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2顯示， 對于尿NAG酶而言，模型組大鼠與對照組比較其在42 d和56 d的增加非常明顯(P<0.05)。使用貝那普利和QGYS的治療組后的大鼠NAG水平下降明顯出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)的42和56 d(P<0.05)。

圖1 各組大鼠24 h尿蛋白變化趨勢

圖2 各組大鼠尿NAG酶變化趨勢

3.4 QGYS對腎功能影響

治療前后各組大鼠腎功能如肌酐和尿素氮未見明顯變化，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.5 QGYS對膠原Ⅳ和FN表達(dá)的影響

表2顯示，模型組腎小球中FN和膠原Ⅳ的表達(dá)明顯高于其他組(P<0.05)。應(yīng)用貝那普利治療或QGYS治療后，模型組可以明顯減少腎小球膠原Ⅳ和FN的表達(dá)水平(P<0.05)。且QGYS與貝那普利治療結(jié)果比較在減少膠原Ⅳ和FN的表達(dá)上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。

表2各組大鼠膠原和纖維連接蛋白在腎皮質(zhì)的表達(dá)情況

組別例數(shù)CoⅣFN對照組80.133±0.0270.164±0.013模型組80.407±0.070*0.466±0.037*貝那普利組80.243±0.018△0.249±0.027△加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯組80.196±0.033△▲0.207±0.012△▲

注：與對照組比較：*P<0.05;與模型組比較：△P<0.05；與貝那普利組比較：▲P<0.05

3.6 QGYS在腎皮質(zhì)對MMP- 9,TIMP-1和TGF-β1影響

表3圖3顯示，模型組與空白對照組比較TIMP-1 mRNA和TGF-β1 mRNA的表達(dá)在腎皮質(zhì)明顯增加，而MMP-9 mRNA表達(dá)明顯降低 (P<0.05)。在觀察貝那普利和QGYS組與模型組比較,明顯降低TIMP-1 mRNA和TGF-β1 mRNA的水平并增加MMP-9 mRNA水平 (P<0.05),且治療效果組間比較QGYS組比貝那普利組更明顯(P<0.05)。

4 討論

QGYS由當(dāng)歸、黃芪和川芎在一定比例配比下制作而成。課題組從2002年開始應(yīng)用中藥方劑的腎臟病變防治研究，在近年來的基礎(chǔ)和臨床研究的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)該方劑在慢性腎臟病治療上有確切療效，逐漸形成具有自主知識產(chǎn)權(quán)的中藥方劑并獲得國家發(fā)明專利證書[8～11]。

表3各組大鼠TIMP-1mRNA,MMP-9mRNAandTGF-β1mRNA在腎皮質(zhì)的表達(dá)情況

組別例數(shù)TIMP-1/β-actionMMP-9/β-actionTGF-β1/β-action對照組80.1736±0.05210.064±0.0190.1810±0.0643模型組80.8654±0.3629*0.010±0.002*0.8167±0.3084*貝那普利組80.1993±0.0931△0.046±0.016△0.2032±0.0602△加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯組80.3322±0.0953△▲0.020±0.007△▲0.3424±0.0595△▲

注：與對照組比較:*P<0.05;與模型組比較:△P<0.05;與貝那普利組比較:▲P<0.05

圖3 各組大鼠在實(shí)驗(yàn)56 d時(shí)TIMP-1、MMP-9 and TGF-β1表達(dá)的情況(RT-PCR和Wester-blot)

腎小球硬化癥和/或腎間質(zhì)纖維化是大多數(shù)慢性腎臟疾病的病理學(xué)表現(xiàn)。阿霉素腎病大鼠具有相似的病理學(xué)特征，阿霉素引起腎病綜合征與蛋白尿。其腎臟的病理改變與文獻(xiàn)報(bào)道的諾霉素或嘌呤霉素及其相似[14],病理改變包括增加腎小球毛細(xì)血管通透性[15]。蛋白尿的出現(xiàn)既是一個(gè)病變發(fā)生的重要標(biāo)志,也是導(dǎo)致腎臟疾病發(fā)生發(fā)展的重要影響因素，減少尿蛋白排泄與延緩腎功能下降之間密切相關(guān)。眾所周知,蛋白尿是引起慢性腎臟病患者腎功能下降的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素?？刂颇虻鞍椎闹委?尤其是使用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(AECI)或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)一直被認(rèn)為是幫助腎臟保護(hù)的重要環(huán)節(jié)[14]。而尿NAG是腎小管損害的重要標(biāo)志,是用來檢測早期或近端腎小管微小損傷的標(biāo)志物[15]。

ECM在腎臟的集聚腎臟超微結(jié)構(gòu)的一個(gè)標(biāo)志，它和腎功能下降直接相關(guān)[16]。TGF-β1被認(rèn)為是在組織纖維化相關(guān)疾病發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵的分子[17～19]。TGF-β1的其中一個(gè)重要影響就是通過刺激間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生各種膠原和ECM蛋白。TGF-β1也降低了金屬蛋白酶的表達(dá)并使基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑的產(chǎn)生和活性增加。這些作用使成纖維細(xì)胞保持和維護(hù)其在持續(xù)激活狀態(tài)的自分泌機(jī)制,導(dǎo)致進(jìn)一步的生產(chǎn)TGF-β1[20]。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPS)在腎臟的主要作用是促進(jìn)基質(zhì)蛋白的降解，其活動受到基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)的調(diào)控。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的一員,具有降解膠原IV、V和VI、FN、層黏連蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)的作用[21]。TIMP-1是腎臟MMP-9的特定抑制劑。生理?xiàng)l件下,MMPs和TIMPs維持一個(gè)動態(tài)平衡調(diào)控ECM的合成和降解。最近的研究表明,MMPs和TIMPs參與許多腎臟疾病[22,23]。然而結(jié)果還有爭議，且對于阿霉素腎病而言MMPs和TIMPs的相關(guān)研究很少。

在我們的研究中,阿霉素腎病大鼠的尿蛋白和NAG酶隨著時(shí)間延長增加明顯。QGYS具有降低尿蛋白和尿NAG的作用，而且在8周治療結(jié)束時(shí)可以減少超過50%的尿蛋白排泄量。治療效果與西藥在大鼠腎小球損傷模型的療效比較相似或者更加顯著[19]。進(jìn)一步QGYS與貝那普利相比顯示出在減少尿NAG方面更好的功效。研究還表明,類似于貝那普利，QGYS可以減少腎小球膠原Ⅳ和FN在腎小球的聚集。本研究結(jié)果表明,早期應(yīng)用QGYS可以有效保護(hù)腎功能，且腎功能的保護(hù)作用與減少ECM積聚相關(guān)。

我們的研究證明，在阿霉素腎病大鼠腎皮質(zhì)TIMP-1的表達(dá)增加和MMP-9的表達(dá)降低進(jìn)而增加TIMP-1/MMP-9的比例使基質(zhì)的降解減少從而導(dǎo)致ECM的聚集。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑貝那普利能夠減少蛋白尿,減少纖維細(xì)胞增殖的作用。腎保護(hù)作用與維護(hù)MMPs和TIMPs在腎臟表達(dá)水平的動態(tài)平衡有關(guān),其直接影響ECM在腎臟的聚集[21]。我們結(jié)合前期研究基礎(chǔ)提出假說，認(rèn)為QGYS治療慢性腎臟病的重要作用機(jī)制在于減少尿蛋白和腎小球ECM積聚從而治療腎臟病。研究表明,QGYS調(diào)節(jié)MMP-9 和TIMP-1的表達(dá)水平從而改變了TIMP-1/MMP-9的比例,同時(shí)減少TGF-β1在阿霉素腎病大鼠腎皮質(zhì)的表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了假說并發(fā)現(xiàn)QGYS在阿霉素腎病模型中治療腎臟病的分子生物學(xué)機(jī)制。

總之,這項(xiàng)研究表明,QGYS是治療阿霉素腎病大鼠有效的藥物。其療效機(jī)制與抑制腎臟ECM積累和改變TGF-β1,TIMP-1和MMP- 9在腎臟皮質(zhì)的表達(dá)從而有利于降解細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)。這些結(jié)果表明,QGYS可能是一個(gè)有前途的預(yù)防和治療腎纖維化的中藥方劑。

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