絞股藍(lán)總皂苷對(duì)光老化人皮膚成纖維細(xì)胞Caspase-3信號(hào)通路的影響

王繼慧，張小卿，馬月丹，張 燚，馬賢德，吳景東

在整體、器官、細(xì)胞和基因、蛋白水平上找到可測(cè)量的異常，已成為中外醫(yī)學(xué)的研究趨勢(shì)[1]。皮膚光老化即因長(zhǎng)期或急性大劑量受到日光照射所導(dǎo)致的皮膚損傷和衰老。皮膚衰老(包括光老化)現(xiàn)代機(jī)制可闡述為，細(xì)胞的遺傳基因調(diào)控是根本，自由基的作用可能為內(nèi)因，細(xì)胞代謝障礙是基礎(chǔ)，環(huán)境因素包括光損傷為外因的衰老機(jī)制理論。細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是機(jī)體穩(wěn)態(tài)維持和DNA損傷細(xì)胞清除的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。細(xì)胞凋亡可調(diào)節(jié)皮膚發(fā)育，在維持皮膚生理穩(wěn)態(tài)和避免腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用[2]。但是，細(xì)胞凋亡過(guò)多，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，容易激發(fā)感染，一些人類皮膚病就是以細(xì)胞凋亡的增加為特征[3]。長(zhǎng)波紫外線(UVA)照射細(xì)胞后，首先在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，成為皮膚光損傷的主要因素。過(guò)量的活性氧會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激并產(chǎn)生細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)錄因子，引起細(xì)胞凋亡[4]。研究認(rèn)為，經(jīng)紫外線輻射受損的細(xì)胞，如果其損傷修復(fù)率提高，凋亡率就明顯下降[5]。

楊靚[6]研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)可以顯著影響細(xì)胞凋亡發(fā)生途徑和結(jié)果，細(xì)胞凋亡與Caspase信號(hào)通路密切相關(guān)；絞股藍(lán)總皂苷(Gyp)具有較強(qiáng)的清除自由基、抗氧化等作用[7]。提示絞股藍(lán)對(duì)光老化皮膚細(xì)胞凋亡可能有保護(hù)性影響。人皮膚結(jié)構(gòu)中，真皮內(nèi)的成纖維細(xì)胞具有合成和分泌蛋白質(zhì)并參與組織損傷后修復(fù)的功能。但關(guān)于絞股藍(lán)對(duì)光老化人皮膚成纖維細(xì)胞(HSF細(xì)胞)凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究目前還十分少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀測(cè)Gyp含藥血清對(duì)光老化HSF細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因和蛋白的調(diào)控，通過(guò)探討Caspase-3信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，期望能揭示Gyp對(duì)光老化HSF細(xì)胞凋亡的保護(hù)性影響。本實(shí)驗(yàn)采用的永生化HSF細(xì)胞作為可在體外傳代的永生化細(xì)胞無(wú)成瘤性，與正常HSF細(xì)胞分化特性高度相似，是研究HSF細(xì)胞的良好工具。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇雄性SPF級(jí)SD大鼠20只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，12 h晝夜節(jié)律。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 HSF細(xì)胞購(gòu)于上海艾研生物科技有限公司；Gyp購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司(批號(hào)：MUST-11031401)；細(xì)胞蛋白提取試劑(批號(hào)：P0013)、BCA法蛋白定量試劑盒(批號(hào)：P0012S)、ECL發(fā)光液(批號(hào)：P0018)購(gòu)于碧云天生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 電熱恒溫振蕩器(SHA-B型)常州國(guó)華儀器設(shè)備廠生產(chǎn)；酶標(biāo)儀(antho2010型)奧地利Anthos公司生產(chǎn)；凝膠成像分析系統(tǒng)(ChemiImager5500型)美國(guó)Alphainnotech Chemi Imager生產(chǎn)；水平搖床(WD-9405B型)北京六一儀器廠生產(chǎn)；垂直板電泳裝置(Mini-Protein Ⅲ型)美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)；電泳儀(EPS300)上海天能科技有限公司生產(chǎn)；轉(zhuǎn)印電泳槽(DYY 40B型)北京六一儀器廠生產(chǎn)；UBA(UV)光源(20 W)訂制于南京華強(qiáng)電子有限公司；紫外光光度計(jì)(UV-340A型)臺(tái)灣路昌電子儀器有限公司生產(chǎn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 含藥血清的制備、細(xì)胞培養(yǎng)和光老化模型復(fù)制 將20只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法平均分為4組，分別是正常血清組和低、中、高劑量含藥血清組，每組5只。根據(jù)Meeh-Rubner公式，算出200 g體質(zhì)量大鼠每天給藥量大約80 mg，并以此作為低劑量含藥血清組大鼠日給藥量，中劑量含藥血清組給藥量是低劑量含藥血清組的2倍，高劑量含藥血清組給藥量是低劑量含藥血清組的4倍。將Gyp溶于0.9%氯化鈉溶液后灌胃，1次/d，共7 d，等第7天灌胃結(jié)束1 h后，主動(dòng)脈取血，于促凝管內(nèi)，室溫靜置1 h，1 200×g離心10 min，收集上清液。將每組大鼠血清分別收集于同一50 ml離心管中，置于56 ℃水浴中滅活，0.22 μm過(guò)濾滅菌，凍存?zhèn)溆?。用?0%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃，5%二氧化碳(CO2)環(huán)境中培養(yǎng)HSF細(xì)胞，隔日傳代。參照陶冶等[8]研究進(jìn)行光老化HSF細(xì)胞模型復(fù)制：紫外線的照射劑量計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[9]，照射劑量(J/cm2)=照射強(qiáng)度(W/cm2)×照射時(shí)間(s)，通過(guò)紫外線輻照計(jì)測(cè)量照射強(qiáng)度，使照射劑量達(dá)到36 J/cm2。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSF細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，以1×104個(gè)/ml的濃度接種于另一培養(yǎng)瓶，5 ml/瓶，共接種25瓶。連續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去舊培養(yǎng)液，加入適量的磷酸鹽緩沖液(PBS)，反復(fù)洗至PBS無(wú)色，加入PBS，2 ml/瓶，于UVA下照射。光源選用UVA 365 nm燈管，采用5根并排照射。培養(yǎng)瓶距燈源15 cm，待照射穩(wěn)定后測(cè)量UVA的照射功率。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組及含藥血清干預(yù) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSF細(xì)胞，棄去舊培養(yǎng)液，以0.25%胰酶消化后加入新鮮培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，以1×104個(gè)/ml接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，共計(jì)30瓶，共分為6組。其中，隨機(jī)抽取5瓶，作為空白對(duì)照組，正常培養(yǎng)，不施加任何干預(yù)因素。其余25瓶細(xì)胞，于37 ℃，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，棄去舊培養(yǎng)液，PBS清洗3次至PBS無(wú)色，加入2 000 μl PBS，放在UVA下照射，待照射穩(wěn)定后測(cè)量UVA的照射功率，選擇36 J/cm2UVA劑量建立光老化HSF細(xì)胞模型。將上述所剩的25瓶經(jīng)過(guò)UVA照射的細(xì)胞隨機(jī)分為5組，采取不同干預(yù)方法，分別為UVA模型組、正常血清干預(yù)組、低劑量含藥血清干預(yù)組、中劑量含藥血清干預(yù)組和高劑量含藥血清干預(yù)組，每組5瓶。其中，UVA模型組HSF細(xì)胞經(jīng)照射后，棄去PBS，加入5 ml新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h；正常血清組HSF細(xì)胞經(jīng)UVA照射后，棄去PBS，加入5 ml含10%正常大鼠血清的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h；低、中、高劑量含藥血清干預(yù)組HSF細(xì)胞經(jīng)UVA照射后，棄去PBS，分別加入5 ml含10%低、中、高劑量大鼠含藥血清的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 采用二氯熒光素(DCF)法檢測(cè)UVA誘導(dǎo)的細(xì)胞活性氧表達(dá) 接種細(xì)胞：96孔板，接種細(xì)胞數(shù)為1.5萬(wàn)/孔。二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)孵育：接種24 h后用有糖Earle′s液洗兩遍，并換上終濃度為25 μmol/L DCFH-DA培養(yǎng)箱孵育30 min。處理：DCFH-DA孵育結(jié)束后，再用有糖Earle′s液洗兩遍給予處理。酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.5.2 增殖反應(yīng)測(cè)定 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)檢測(cè)各組HSF細(xì)胞活性。無(wú)菌操作取各組單個(gè)細(xì)胞懸液，用Hanks液洗3次，每次離心10 min(800×g)。用苔盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)為96%，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整濃度至5×108/ml，將細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板，100 μl/孔。分別設(shè)定刺激孔和對(duì)照孔，刺激孔加入Con-A(終濃度為5 μg/ml)，對(duì)照孔加入等量的RPMI-1640培養(yǎng)液，同時(shí)刺激孔和對(duì)照孔再設(shè)3個(gè)平行孔，混勻后，將培養(yǎng)板置于37 ℃含5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72 h。在培養(yǎng)結(jié)束前4 h取出培養(yǎng)板，向每孔中加入噻唑藍(lán)15 μl(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，輕輕棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，在振蕩器上振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上490 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔光密度值(OD值)。

1.5.3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western-blotting法檢測(cè)細(xì)胞Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)情況 RT-PCR：分別進(jìn)行光老化各組HSF細(xì)胞總RNA提取、cDNA第一鏈合成、PCR和瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。在波長(zhǎng)為254 nm的紫外燈下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，于凝膠成像系統(tǒng)中拍照并保存數(shù)據(jù)。Western-blotting：收集細(xì)胞，PBS漂洗并裂解細(xì)胞，然后測(cè)定Caspase-3濃度，30%聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，將麗春紅染色過(guò)的PVDF膜用去離子水漂洗3次，洗去紅色條帶。置于25 ml封閉液中，室溫?fù)u床上緩慢搖動(dòng)1 h，一抗稀釋于封閉液中4 ℃搖晃過(guò)夜，三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBS/T)漂洗3次；二抗稀釋于封閉液中，室溫?fù)u晃1 h，再以TBS/T漂洗3次，蛋白信號(hào)由ECL試劑盒檢測(cè)，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 各組HSF細(xì)胞活性氧水平比較 6組HSF細(xì)胞活性氧(平均熒光強(qiáng)度)及活性氧水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其中與空白對(duì)照組比較，UVA模型組、正常血清干預(yù)組、低劑量含藥血清干預(yù)組、中劑量含藥血清干預(yù)組和高劑量含藥血清干預(yù)組HSF細(xì)胞活性氧(平均熒光強(qiáng)度)及活性氧水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與UVA模型組和正常血清干預(yù)組比較，低劑量含藥血清干預(yù)組、中劑量含藥血清干預(yù)組、高劑量含藥血清干預(yù)組HSF細(xì)胞活性氧(平均熒光強(qiáng)度)及活性氧水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)表1)。

表1 6組HSF細(xì)胞活性氧水平比較Table 1 Comparison of reactive oxygen species in each group of HSF

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與UVA模型組比較，▲P<0.01；與正常血清干預(yù)組比較，△P<0.01

2.2 各組HSF細(xì)胞增殖活性比較 6組HSF細(xì)胞OD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其中與空白對(duì)照組比較，UVA模型組、正常血清干預(yù)組、低劑量含藥血清干預(yù)組、中劑量含藥血清干預(yù)組、高劑量含藥血清干預(yù)組OD值降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與UVA模型組及正常血清干預(yù)組比較，中劑量含藥血清干預(yù)組、高劑量含藥血清干預(yù)組OD值升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)表2)。

表2 6組HSF細(xì)胞OD值比較Table 2 Comparison of OD of each group of HSF

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與UVA模型組比較，▲P<0.01；與正常血清干預(yù)組比較，△P<0.01

2.3 各組HSF細(xì)胞Caspase-3 mRNA表達(dá)水平比較 6組HSF細(xì)胞Caspase-3 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其中與空白對(duì)照組比較，UVA模型組、正常血清干預(yù)組、低劑量含藥血清干預(yù)組、中劑量含藥血清干預(yù)組、高劑量含藥血清干預(yù)組Caspase-3 mRNA表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與UVA模型組及正常血清干預(yù)組比較，低劑量含藥血清干預(yù)組、中劑量含藥血清干預(yù)組、高劑量含藥血清干預(yù)組Caspase-3 mRNA表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與低劑量含藥血清干預(yù)組比較，中劑量含藥血清干預(yù)組、高劑量含藥血清干預(yù)組Caspase-3 mRNA表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與中劑量含藥血清干預(yù)組比較，高劑量含藥血清干預(yù)組Caspase-3 mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)表3、圖1)。

2.4 各組HSF細(xì)胞Caspase-3表達(dá)水平比較 6組HSF細(xì)胞Caspase-3表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其中與空白對(duì)照組比較，UVA模型組、正常血清干預(yù)組、低劑量含藥血清干預(yù)組、中劑量含藥血清干預(yù)組、高劑量含藥血清干預(yù)組Caspase-3表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與UVA模型組和正常血清干預(yù)組比較，低劑量含藥血清干預(yù)組、中劑量含藥血清干預(yù)組、高劑量含藥血清干預(yù)組Caspase-3表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與低劑量含藥血清干預(yù)組和中劑量含藥血清干預(yù)組比較，高劑量含藥血清干預(yù)組Caspase-3表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)表4、圖2)。

3 討論

中國(guó)醫(yī)學(xué)典籍中的“陽(yáng)淫”“明淫”致病學(xué)說(shuō)，討論了日光過(guò)度照射而致熱疾的發(fā)病機(jī)制。中醫(yī)診治的面部損美性疾病如黧黑斑、雀斑和黑變病等，病因病機(jī)都涉及日光照射皮膚所致的損害，提示光毒是誘發(fā)皮膚損傷乃至日久引起皮膚老化和損美性疾病的主要外感因素[10]。

注：A空白對(duì)照組，B UVA模型組，C正常血清干預(yù)組，D低劑量含藥血清干預(yù)組，E中劑量含藥血清干預(yù)組，F(xiàn)高劑量含藥血清干預(yù)組

圖1 RT-PCR法檢測(cè)各組HSF細(xì)胞中Caspase-3 mRNA表達(dá)

Figure1 Caspase-3 mRNA expression of each group of HSF determined by RT-PCR

表3 6組HSF細(xì)胞Caspase-3 mRNA表達(dá)水平比較Table 3 Comparison of Caspase-3 mRNA expression of each group of HSF

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與UVA模型組比較，●P<0.01；與正常血清干預(yù)組比較，△P<0.01；與低劑量含藥血清干預(yù)組比較，▲P<0.01；與中劑量含藥血清干預(yù)組比較，☆P<0.01

表4 6組HSF細(xì)胞Caspase-3表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of Caspase-3 protein expression of each group of HSF

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與UVA模型組比較，●P<0.01；與正常血清干預(yù)組比較，△P<0.01；與低劑量含藥血清干預(yù)組比較，▲P<0.01；與中劑量含藥血清干預(yù)組比較，☆P<0.01

注：A空白對(duì)照組，B UVA模型組，C正常血清干預(yù)組，D低劑量含藥血清干預(yù)組，E中劑量含藥血清干預(yù)組，F(xiàn)高劑量含藥血清干預(yù)組

圖2 Western-blotting法檢測(cè)各組HSF細(xì)胞中Caspase-3表達(dá)

Figure2 Caspase-3 protein expression of each group of HSF determined by Western-blotting

中藥絞股藍(lán)味甘微苦性寒，歸脾肺腎三經(jīng)，具益氣養(yǎng)陰、健脾胃、清肺熱之功。現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Gyp有顯著鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗疲勞等作用，與皮膚光老化損傷的防治目標(biāo)相吻合[11-13]。

近年體內(nèi)研究證實(shí)，絞股藍(lán)具有一定的抗皮膚光老化作用[14]。Gyp為絞股藍(lán)主要藥理成分，其藥理作用可能與絞股藍(lán)有相似之處。故在本研究中，將Gyp作為干預(yù)因素施加于大鼠，以制備含藥血清。

研究表明，紫外線輻射可使HSF細(xì)胞的膠原合成減少，使皮膚失去緊致和彈力，產(chǎn)生皮膚皺紋，并誘導(dǎo)光老化發(fā)生[15]。皮膚光老化與UVA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生密切相關(guān)。本研究證實(shí)，UVA模型組HSF細(xì)胞凋亡顯著增加。當(dāng)采用Gyp含藥血清干預(yù)后，細(xì)胞增殖活性則明顯上升，且高劑量含藥血清組干預(yù)效果最為顯著，提示Gyp對(duì)細(xì)胞的積極作用。

細(xì)胞在生理狀態(tài)下，通過(guò)正常代謝過(guò)程而產(chǎn)生的各種活性氧，在抗氧化物質(zhì)作用下能夠及時(shí)被清除。當(dāng)紫外線作用于細(xì)胞，首先是細(xì)胞內(nèi)發(fā)色基團(tuán)(包括：DNA、尿刊酸、芳香族氨基酸等)吸收其電磁能量，并將其轉(zhuǎn)化為化學(xué)能量，譬如與氧分子相互作用，產(chǎn)生活性氧簇[16-17]。當(dāng)細(xì)胞受到過(guò)度刺激而使活性氧產(chǎn)生過(guò)多，可導(dǎo)致細(xì)胞細(xì)胞凋亡甚至壞死。本研究中UVA誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量活性氧，提示活性氧在紫外線光老化中起著重要作用，這與以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[18]。而Gyp含藥血清干預(yù)后HSF細(xì)胞中活性氧水平下調(diào)，表明絞股藍(lán)可以緩解或減輕紫外線誘導(dǎo)的光老化HSF細(xì)胞毒性，并使損傷得到明顯恢復(fù)，對(duì)細(xì)胞活性具有保護(hù)性作用。

細(xì)胞內(nèi)線粒體基因組(線粒體DNA) 突變率可以很好反映皮膚中UVA的累積損傷，因?yàn)樵摫壤c年齡無(wú)關(guān)，而與皮膚光老化的程度有關(guān)[19]。UVA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜事件，人體皮膚通過(guò)細(xì)胞凋亡來(lái)消除光損傷細(xì)胞，涉及不同的途徑。其中的細(xì)胞色素C釋放和Caspase激活的生物化學(xué)通路，主要在細(xì)胞受到死亡受體非依賴性刺激時(shí)被激活，并有放大死亡受體通路信號(hào)的作用，而紫外線輻射就屬于這類刺激。該通路中，Caspase蛋白家族的級(jí)聯(lián)激活起著重要作用，Caspase激活是凋亡發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[20-21]。生理狀態(tài)下，Caspase家族在胞質(zhì)中以酶原形式存在。UVA輻射通過(guò)某些途徑促使線粒體釋放細(xì)胞色素C等促凋亡因子，促使Caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體，Caspasde-9被激活后，引起Caspase-3的激活，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase-3作為Caspase家族成員中執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶之一，是細(xì)胞凋亡的中樞效應(yīng)器[22]。又有研究證實(shí)，線粒體通路激活的標(biāo)志性蛋白就是Caspase-3，多種刺激因素的啟動(dòng)信號(hào)均可激活Caspase-3，然后裂解多種蛋白，阻止DNA復(fù)制和細(xì)胞修復(fù)破壞細(xì)胞核整體結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，Caspase-3活化程度可作為判斷細(xì)胞凋亡嚴(yán)重性的可靠指標(biāo)之一[23-24]。

本研究發(fā)現(xiàn)，UVA模型組HSF細(xì)胞中Caspase-3基因和蛋白表達(dá)都上升，提示UVA刺激HSF細(xì)胞后，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，Caspase-3被活化，從而啟動(dòng)下游凋亡信號(hào)，可引起細(xì)胞凋亡現(xiàn)象發(fā)生。但當(dāng)加入抗氧化劑Gyp后，各組光老化模型細(xì)胞中Caspase-3基因和蛋白表達(dá)下調(diào)，即Gyp下調(diào)了由該通路發(fā)生的DNA轉(zhuǎn)錄水平，提示Gyp作為功效良好的抗氧化劑，可以拮抗紫外線誘導(dǎo)的光老化HSF細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，緩解細(xì)胞遭受不利因素的刺激強(qiáng)度，最終減輕光老化損傷程度、減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，起到對(duì)HSF細(xì)胞抵抗紫外線損傷的保護(hù)作用。其作用機(jī)制包括抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧的過(guò)量生成，也包括抑制與細(xì)胞凋亡相關(guān)的Caspase家族信號(hào)通路的活性，最終減輕UVA誘導(dǎo)的HSF細(xì)胞光老化現(xiàn)象，提示絞股藍(lán)對(duì)光老化HSF細(xì)胞有一定保護(hù)作用。

1 Kern PA,Ranganathan S,Li C,et al.Adipose tissue tumor necrosis factor and interleukin-6 expression in human obesity and insulin resistance [J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2001,280(5):E745-751.

2 Pustisek N,Situm M.UV-radiation,apoptosis and skin [J].Coll Antropol，2011,35(Suppl 2):339-341.

3 胡野，凌志強(qiáng).細(xì)胞凋亡與分子醫(yī)學(xué)[M].北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2002：20-21.

4 Zhou BR,Yin HB,Xu Y,et al.Baicalin protects human skin fibroblasts from ultraviolet A radiation-induced oxidative damage and apoptosis[J].Free Radic Res，2012,46(12):1458-1471.

5 Kulms D,P?ppelmann B,Yarosh D,et al.Nuclear and cell membrane effects contribute independently to the induction of apoptosis in human cells exposed to UVB radiation [J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(14):7974-7979.

6 楊靚.絞股藍(lán)總皂苷誘導(dǎo)小鼠白血病L1210細(xì)胞凋亡及機(jī)制探討[D].西安：陜西師范大學(xué)，2011.

7 黃梅，王學(xué)軍，楊凱.中藥抗氧化成分及抗氧化活性的體外評(píng)價(jià)方法[J].重慶科技學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，8(3)：109-112.

8 陶冶，張小卿，馬賢德，等.絞股藍(lán)總皂苷含藥血清對(duì)光老化HaCaT細(xì)胞NF-κB通路的影響[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47(10)：1178-1181.

9 李薇.長(zhǎng)波紫外線對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)目及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)的影響[D].長(zhǎng)沙:中南大學(xué),2007.

10 劉寧.美容中醫(yī)學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：329-334.

11 李楠，谷繼卜，曲桂霞.絞股藍(lán)水煎劑對(duì)老齡小鼠SOD和LPO的抗衰老研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2012，35(4)：41.

12 李杰，楊舟，詹琤琤.絞股藍(lán)化學(xué)成分與藥理作用研究概況[J].湖北中醫(yī)雜志，2012，34(10)：74-76.

13 蘇齊鑒，梁飛立，李益忠，等.絞股藍(lán)總甙片聯(lián)合山楂精降脂片治療高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療后血脂異常的療效研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2012，15(11)：3903.

14 吳景東.絞股藍(lán)抗皮膚光老化的實(shí)驗(yàn)研究[D].沈陽(yáng)：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2006.

15 Tang S,Lucius R,Wenck H,et al.UV-mediated downregulation of the endocytic collagen receptor,Endo180,contributes to accumulation of extracellular collagen fragments in photoaged skin[J].J Dermatol Sci,2013,70(1):42-48.

16 Valencia A,Kochevar IE.Nox1-based NADPH oxidase is the major source of UVA-induced reactive oxygen species in human keratinocytes [J].J Invest Dermatol,2008,128(1):214-222.

17 Dwivedi N,Flora SJ.Concomitant exposure to arsenic and organophosphates on tissue oxidative stress in rats [J].Food Chem Toxicol，2011，49(5)：1152-1159.

18 Bossi O,Gartsbein M,Leitges M,et al.UV irradiation increases ROS production via PKCdelta signaling in primary murine fibroblasts[J].J Cell Biochem，2008,105(1):194-207.

19 Brirch-Machin MA.Tindall M,Turner R,et al.Mitochondrial DNA deletions in human skin reflect photo- rather than chronologic aging [J].J Invest Dermatol,1998，110(2):149-152.

20 薛書(shū)霞，張景華，李景武,等.P53、Caspase-3和凋亡調(diào)節(jié)蛋白FasL在乳腺癌的表達(dá)及其意義[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，18(1)：21-23.

21 蔣令修，王金蘭，婁季宇,等.硫酸鎂對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠細(xì)胞凋亡及Caspase-3表達(dá)的影響[J].疑難病雜志，2012，11(2)：120.

22 Earnshaw WC,Martins LM,Kaufmann SH,et al.Mammalian caspased:structure,activation,substrates,and functions during apoptosis [J].Annu Rev Biochem,1999,68:383-424.

23 Wang XH，Zhang L，Mitch WE,et al.Caspase-3 cleaves specific 19 S proteasome subunits in skeletal muscle stimulating proteaseme activity [J].Biol Chem，2010，285(28):21249-21257.

24 李里，宮亮，吳玉斌.增殖細(xì)胞核抗原和caspase-3在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型中的表達(dá)及其意義[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2012，15(10)：3489.