新加良附方聯(lián)合5-Fu對荷人胃癌裸鼠血清VEGF、bFGF水平的影響

侯 麗許 晶王 婧郭曉青宋延平

（1北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院腫瘤血液科，北京，100700；2陜西中醫(yī)學院，咸陽，712046；3陜西省中醫(yī)藥研究院藥理室，西安，710003）

新加良附方聯(lián)合5-Fu對荷人胃癌裸鼠血清VEGF、bFGF水平的影響

侯 麗1許 晶2王 婧1郭曉青1宋延平3

（1北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院腫瘤血液科，北京，100700；2陜西中醫(yī)學院，咸陽，712046；3陜西省中醫(yī)藥研究院藥理室，西安，710003）

目的：觀察新加良附方聯(lián)合5-Fu對荷人胃癌移植瘤裸鼠血清血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）、堿性成纖維生長因子（Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）水平的影響。方法：建立移植性人胃癌細胞（SGC-7901）裸鼠移植瘤模型，并將模型動物隨機分為空白組、5-Fu組及新加良附方高、中、低劑量組、聯(lián)合給藥組（新加良附中劑量+5-Fu組）6組。新加良附方高、中、低劑量組給藥劑量分別為10 g·d-1·kg-1、5 g·d-1·kg-1、2.5 g·d-1·kg-1；5-Fu組給藥劑量為17 mg·d-1·kg-1；空白組給予等量無菌生理鹽水，新加良附方聯(lián)合5-Fu組劑量為新加良附方中劑量（5 g·d-1·kg-1）聯(lián)合應用5-Fu（17 mg·d-1·kg-1）。給藥結(jié)束后，采用免疫學方法（ELISA）檢測裸鼠血清中VEGF、bFGF的含量。結(jié)果：VEGF含量顯示：聯(lián)合給藥組，5-Fu組，新加良附大、中、小劑量組裸鼠血清中含量較空白對照組均明顯降低（P＜0.01），新加良附各劑量組對VEGF含量減低作用具有一定的劑量依賴性，聯(lián)合用藥組VEGF含量低于5-Fu組、新加良附中劑量組，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。bFGF含量顯示：聯(lián)合給藥組，5-Fu組，新加良附大、中、小劑量組裸鼠血清中含量較空白對照組均明顯降低（P＜0.01）。結(jié)論：新加良附方可以下調(diào)人胃癌裸鼠的血清中VEGF、bFGF表達水平，提示新加良附方具有一定抗胃癌新生血管生成作用。

新加良附方；新加良附方聯(lián)合5-Fu；VEGF；bFGF

腫瘤血管生成是指腫瘤組織在已存在微血管床基礎(chǔ)上，以毛細血管為主的新生血管系統(tǒng)芽生與發(fā)展過程，是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要病理學基礎(chǔ)。自70年代初Folkman等［1］首先提出腫瘤生長依賴于新生血管生成以來，腫瘤血管生成機理與腫瘤血管抑制劑研究日趨活躍。經(jīng)過幾十年的應用基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤新生血管形成是腫瘤發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移的重要生物學行為。新加良附方由《良方集腋》中的良附丸加味而來，由高良姜、香附和穿山龍三味藥物組成，處方中單味藥均有抗癌作用的文獻報道［2-7］。在前期新加良附方抗腫瘤血管生成的體內(nèi)研究中，我們發(fā)現(xiàn)，新加良附方可以下調(diào)抑制移植型小鼠肝癌H22實體瘤組織中VEGF表達和微血管密度（Microvessel Density，MVD），初步表明新加良附方可能通過抑制腫瘤血管生成而發(fā)揮抗腫瘤效應［8］；新加良附方大、中劑量組可以抑制移植型人胃癌MGC803實體瘤組織的MVD、下調(diào)VEGF蛋白表達，表明新加良附方能夠抑制人胃癌新生血管形成［9］。為進一步探討新加良附方抗腫瘤血管生成效應及其機制，我們進行本次體內(nèi)實驗，從分子水平觀測其對荷人胃癌SGC-7901移植瘤裸鼠血清中血管生成相關(guān)因子表達的影響。

1 材料

1.1 動物及細胞系 BALBC無胸腺裸鼠，SPF級，4～5周齡，60只，雌雄各半，購于中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（湘）2011-00023，合格證號：4300470001967，在第四軍醫(yī)大學動物實驗中心屏蔽系統(tǒng)輔以潔凈層流柜環(huán)境中飼養(yǎng)。人胃癌（SGC-7901）細胞系，購于第四軍醫(yī)大學實驗動物中心。

1.2 主要藥物 按照中藥新藥制備工藝制備，新加良附方（浸膏或干燥原粉）由陜西星華制藥有限公司提供；陽性藥：注射用5-氟尿嘧啶（5-Fu）由上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準字：H31020593，產(chǎn)品批號110608。

1.3 儀器與試劑 實驗試劑：1640培養(yǎng)液購自Gibco公司；小牛血清購自杭州四季青公司；胰蛋白酶；VEGF、bFGF酶聯(lián)免疫吸附檢測（ELISA）試劑盒。實驗儀器：超凈工作臺SW-CJ-IF（美國BIOLOGICAL公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國SHELDON公司）；TDZ4AWS臺式低速自動平衡離心機；低溫冰箱（日本SANYO公司）；酶標儀（美國伯樂）。

2 方法

2.1 復蘇與培養(yǎng) 液氮罐中取出含有SGC-7901細胞的凍存管，放入37℃水浴內(nèi)，使其溶化吸取細胞懸液并加入培養(yǎng)液（10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液），人胃癌細胞株SGC-7901置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃飽和溫度，5%CO2條件下培養(yǎng)傳代。待細胞長滿單層，用0.25%胰酶消化，培養(yǎng)液吹打離心1 000 rmin，5 min，去上清液收集細胞，傳代培養(yǎng)或接種。

2.2 接種 將收集的細胞用PBS稀釋，鏡下細胞計數(shù)，調(diào)整細胞懸液濃度至1×107個細胞m L，每只裸鼠以0.2 mL接種于頸背部，待腫瘤長至1 000 mm3時移植。

2.3 分組 待已接種裸鼠腫瘤體積約在100～300 mm3之間時，據(jù)性別，腫瘤體積大小將造模成功的裸鼠分成六組，空白組、5-Fu陽性對照組、新加良附大劑量組、新加良附中劑量組、新加良附小劑量組、聯(lián)合給藥組（即新加良附中劑量+5-Fu組），10只組，稱重標號。

2.4 給藥劑量時間及方法 空白組：以生理鹽水每天0.2 mL10 g灌胃；5-Fu組：按17 mg·d-1·kg-1體質(zhì)量腹腔注射，2次周。新加良附方各劑量組：高劑量組以10 g·d-1·kg-1灌胃給藥，相當于成人劑量的20倍；中劑量組以5 g·d-1·kg-1灌胃給藥，相當于成人劑量的10倍；小劑量組以2.5 g·d-1·kg-1灌胃給藥，相當于成人劑量的5倍。聯(lián)合給藥組：即新加良附中劑量組與5-Fu聯(lián)合給藥，新加良附中劑量與5-Fu劑量同上，連續(xù)給藥10 d。

2.5 標本收集及檢測方法 給藥第10 d后，裸鼠眼球取血1 mL，離心后取血清凍存，采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗夾心法（ELISA）檢測VEGF、bFGF的表達水平，嚴格按照說明書由專人操作。

表1 各組VEGF、bFGF蛋白表達水平（pg·mL-1）

3 結(jié)果

VEGF含量顯示：聯(lián)合給藥組，5-Fu組，新加良附大、中、小劑量組裸鼠血清中VEGF含量較空白對照組均明顯降低（P＜0.01），且新加良附方各組對VEGF抑制作用具有一定的量效關(guān)系。聯(lián)合用藥組VEGF含量低于與新加良附中劑量組及5-Fu組，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。bFGF含量顯示：聯(lián)合給藥組，5-Fu組，新加良附大、中、小劑量組裸鼠血清中bFGF含量較空白對照組均明顯降低（P＜0.01），新加良附方各劑量組bFGF含量無明顯量效關(guān)系，見表1。

4 結(jié)論

胃癌在世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤中排名第四，為第二大癌癥死因［10-11］。根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計及2012年中國腫瘤登記年報數(shù)據(jù)顯示，2009年胃癌位居我國惡性腫瘤發(fā)病率第二位，死亡率第三位，發(fā)病人數(shù)占全球胃癌發(fā)病總?cè)藬?shù)的一半左右，是胃癌大國，與日韓等國不同，我國胃癌發(fā)病率和病死率高、僅10%左右為早期胃癌、以進展期病例為主要診治對象等特點。近年來新發(fā)胃癌患者呈現(xiàn)年輕化趨勢，30歲以下年輕患者的比例由上世紀70年代的1.7%躥升至當前的3.3%，嚴重影響了社會勞動力和社會生產(chǎn)，給家庭和社會帶來了很大危害［12］。近年來，隨著新藥的開發(fā)和新方法的應用，晚期胃癌的治療效果有一定程度的提高，但遠不如人們期望的那樣樂觀。中醫(yī)藥在緩解臨床癥狀、對化放療減毒與增效、提高患者生活質(zhì)量、預防腫瘤復發(fā)與轉(zhuǎn)移等方面具有優(yōu)勢與特色。通過臨床實踐發(fā)現(xiàn)，在胃癌發(fā)生與進展過程中，常有胃脘部隱痛、畏寒怕冷、得溫則舒、遇寒加重等前驅(qū)癥狀，結(jié)合胃部腫塊、脹痛、食欲減退、噯氣或嘔吐、疲乏、脹痛、形體消瘦、舌質(zhì)青紫、脈象細澀等臨床特征，與“寒主收引、主凝滯、主痛”等中醫(yī)理論相符，其病機關(guān)鍵是“寒凝→氣滯→血瘀”，故而確立了“溫陽散寒，理氣活血”為胃癌基本治療原則［13-15］，擬定由高良姜、香附、穿山龍組成的新加良附方（高良姜：香附：穿山龍為1∶1∶2），方中高良姜性味辛、大熱，歸脾、胃經(jīng)，具有溫中暖胃、散寒止痛之功效，為君藥，針對寒邪凝結(jié)脾胃治療；香附性味辛、微苦、微甘、平，歸肝、脾、三焦經(jīng)，具有疏肝理氣之功效，為臣藥，協(xié)助君藥理寒凝之氣滯，疏肝行氣以止痛。兩藥相配，一散寒凝，二行氣滯。穿山龍性味甘、苦、溫，歸心、肺經(jīng)，活血通絡(luò)，化瘀行血為佐藥，助君藥化寒凝之血瘀，協(xié)臣藥理寒凝之氣滯。三藥合用具有“溫胃散寒，理氣活血”之功效，用以治療或輔助治療中晚期胃癌，在前期體內(nèi)外實驗及臨床應用中取得一定療效［16-17］。

胃癌生長具有明確的血管依賴。表皮生長因子受體（Epithelial Growth Factor Receptor，EGFR）、血管內(nèi)皮生長因子受體（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor，VEGFR）和人表皮生長因子受體-2（Human Epidermal Growth Factor Receptor2，HER-2）的過表達與胃癌患者較差的預后存在相關(guān)性［18］。臨床試驗證明曲妥珠單抗（抗HER-2抗體）聯(lián)合化療對HER-2陽性的晚期胃癌或食管癌患者臨床療效優(yōu)于單純化療［19］。貝伐珠單抗（抗VEGFR抗體）、索拉非尼和西妥昔單抗（抗EGFR抗體）的安全性及療效也得到了II期臨床試驗初步肯定。基于AVAGAST研究顯示的PFS優(yōu)勢，提示應進一步開展抗新生血管生成研究。中藥或有效成分抑制腫瘤血管生成研究包括單味中藥及其提取物以及中藥復方的研究，如人參與人參皂苷Rg3［20-21］、莪術(shù)與欖香烯［22］等多項研究。

課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)新加良附大、中劑量組能夠抑制移植型人胃癌MGC803實體瘤模型以CD31作為標記的MVD，因此認為調(diào)控胃癌新生血管可能是新加良附顆粒抑制胃癌生長的效應機制之一［9］。腫瘤血管生成受到促血管生成因子（如VEGF、bFGF）的正反饋調(diào)節(jié)。本研究通過檢測裸鼠血清中VEGF和bFGF表達水平來評估新加良附方的抗血管生成效應及機制。其中，VEGF是血管內(nèi)皮細胞生長增殖的主要因子，對腫瘤血管生成具有較強和特異的調(diào)節(jié)作用，通過與血管內(nèi)皮細胞生長因子受體結(jié)合，引起一系列的信號轉(zhuǎn)導，刺激血管（淋巴管）內(nèi)皮細胞增殖和遷移，VEGF高表達促進了腫瘤微血管生成且與胃癌進展密切相關(guān)，并與神經(jīng)纖毛蛋白-1（Neuropilin-1，NRP-1）表達存在協(xié)同關(guān)系［23］。本研究顯示新加良附方可以下調(diào)荷人胃癌移植瘤裸鼠血清中VEGF表達水平，且該作用具有一定的劑量依賴性；新加良附方和5-Fu聯(lián)合用藥對VEGF表達抑制作用優(yōu)于單獨用藥，但尚無統(tǒng)計學意義。bFGF是成纖維細胞生長因子家族中的一員，對多種細胞具有促進增殖促分化的功能，是一種生物活性較強的促分裂素，定位于染色體4q。bFGF不僅能刺激和調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞等分化增殖，還可促進成纖維細胞產(chǎn)生膠原，調(diào)控基質(zhì)合成和降解，在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移和血管生成方面發(fā)揮重要作用，與VEGF、PDGF等細胞因子相互協(xié)同組成血管新生的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)［24］。本項研究顯示新加良附方可以下調(diào)荷人胃癌移植瘤裸鼠血清中bFGF表達水平，但無明顯量效關(guān)系。綜上所述，本研究選擇VEGF、bFGF兩項指標從從血管生成角度進行了研究探討，發(fā)現(xiàn)新加良附方可以下調(diào)人胃癌裸鼠的血清中VEGF、bFGF表達水平，且對VEGF作用具有量效關(guān)系，提示其具有一定抗胃癌新生血管生成作用。但血管生成是一個復雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，這兩項指標還遠遠不夠，僅依賴某一因子的變化評價療效存在不確定性，應在下一步研究中綜合考慮多個因子的變化，從動態(tài)平衡的角度予以評價。

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（2014-02-11收稿 責任編輯：徐穎）

The Effects of Modified Liang-Fu Formula Combined with 5-Fu on VEGF，bFGF Expression of Human Gastric Cancer Xenografts in Nude Mice

Hou Li1，Xu Jing2，Wang Jing1，Song Yanping3
（1 Department of Oncology and Hematology，Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China；2 Shanxi College of Traditional Chinese Medicine，Shanxi Xianyang 712046，China；3 Pharmacology Department，Shanxi Institute of Traditional Chinese Medicine，Shanxi Xi'an 710003，China）

Objective：To observe the effect of Modified Liang-fu Formula（MLFF）combined with 5-Fu on VEGF and bFGF expression in the serum of human gastric cancer xenografted nude mice.Methods：The animal model of SGC-7901 xenografted nude mice was established，and all the mice were randomly divided into 6 groups；namely model control group（the same amount of normal sterile saline），5-Fu group（17 mg·d-1·kg-1），MLFF high-dose group（10 g·d-1·kg-1），MLFF medium-dose group（5 g·d-1·kg-1），MLFF low-dose group（2.5 g·d-1·kg-1）and drug combination group（5 g·d-1·kg-1MLFF combined with 17 mg·d-1·kg-15-Fu）. After 10 days of continuous treatment，eyeball blood was withdrew，them ice were killed，and the expression of VEGF and bFGF in the serum were detected using ELISA method.Results：Compared to model control group，the expression levels of VEGF in nude mice serum were significantly reduced in 5-Fu group，MLFF high-dose group，MLFF medium-dose group，MLFF low-dose group and drug combination group，respectively（P＜0.01），while MLFF reduced VEGF expression in a dose-dependent manner.The combination group showed a lower level of VEGF compared to 5-Fu group and MLFF medium-dose group，but there was no significant difference（P＜0.05）.Meanwhile，compared to model control group，the expression level of bFGF in nude mice serum was significantly decreased in 5-Fu group，MLFF high-dose group，MLFF medium-dose group，MLFF low-dose group and drug combination group，respectively（P＜0.01）.Conclusion：MLFF can down-regulate the expression of VEGF，bFGF in the serum of human gastric cancer xenografted nude mice.It indicates thatMLFF has the potential to serve as anti-angiogenesis agent for gastric cancer.

Modified Liang-fu formula；Modified Liang-fu formula combined with 5-Fu；VEGF；bFGF

R287

A

10.3969j.issn.1673-7202.2014.12.020

北京中醫(yī)藥大學科學科研基地建設(shè)項目北京市重點實驗室（中醫(yī)內(nèi)科學）——新加良附方抗胃癌效應機制研究（編號：2011-JDJS-02）

宋延平（1964.6—），男，大學本科學歷，研究員，藥理研究室主任，研究方向：中藥抗腫瘤新藥的研究，E-mail：sypdd2003＠163.com