O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶在子宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義

張志勇，鄧榮春，周愛(ài)群，施橋發(fā)

(1、江西省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006;2、南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,江西南昌330000)

·論著·

O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶在子宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義

張志勇1，鄧榮春1，周愛(ài)群1，施橋發(fā)2

(1、江西省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006;2、南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,江西南昌330000)

目的探討O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)在子宮頸癌組織中表達(dá)情況及其臨床意義。方法采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)子宮頸癌組織中MGMT的表達(dá)。結(jié)果60例子宮頸癌組織中MGMT的陽(yáng)性表達(dá)率為93.33%，顯著高于14例對(duì)照正常宮頸組織中陽(yáng)性率42.8%,(P＜0.05)；子宮頸癌患者中，Ⅰ期與Ⅱ期的MGMT陽(yáng)性率分別為100%、95.83%，顯著高于Ⅲ-Ⅳ期的陽(yáng)性率62.5%(P＜0.01)。結(jié)論MGMT的表達(dá)水平與宮頸組織癌變發(fā)展的進(jìn)程相關(guān)，其在宮頸癌組織的高表達(dá)可為宮頸癌的診斷提供重要依據(jù)。

∶O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶；子宮頸癌；免疫組織化學(xué)染色

子宮頸癌在年輕女性中的發(fā)病率僅次于乳腺癌排在第二位，世界范圍內(nèi)統(tǒng)計(jì)(2000年)每年大約有50萬(wàn)左右的宮頸癌新發(fā)病例，25萬(wàn)人死于子宮頸癌，其中80%的病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，50%的病例發(fā)生在亞洲[1]。中國(guó)每年有15萬(wàn)左右新發(fā)病例，有大約10萬(wàn)人死于子宮頸癌，因此，宮頸癌是我國(guó)女性最常見(jiàn)的腫瘤之一。O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine DNA methyltransferase MGMT)是將O6-鳥(niǎo)嘌呤加合物從DNA上移除，對(duì)損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)的酶。它能特異性的修復(fù)DNA序列中的O6烷基鳥(niǎo)嘌呤損傷，維持基因組的精確性和完整性，是人類細(xì)胞中至今為止發(fā)現(xiàn)的唯一修復(fù)該損傷的甲基轉(zhuǎn)移酶[2]。Reese等[3]研究發(fā)現(xiàn)，MGMT含量與腫瘤發(fā)生相關(guān)，正常組織中一定水平的MGMT表達(dá)可抑制突變發(fā)生和原癌基因活化。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究06-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶在子宮頸癌組織中的表達(dá)情況，并與其正常宮頸組織中表達(dá)情況相比較，探討其在子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料以江西省人民醫(yī)院腫瘤科與婦產(chǎn)科2011年3月至2012年1月經(jīng)病理確診的60例子宮頸鱗癌組織為癌組，年齡32～74歲、平均(54.2± 10.3)歲，按照國(guó)際腫瘤協(xié)會(huì)FIGO 2009修訂的國(guó)際診斷和分期法，Ⅰ期28例、Ⅱ期24例、Ⅲ～Ⅳ期8例。對(duì)照組為14例子宮肌瘤患者行子宮切除術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)的正常宮頸組織，年齡29～62歲、平均(46.2±7.7)歲。所有患者均無(wú)惡性腫瘤史并排除乙肝表面抗原陽(yáng)性個(gè)體，術(shù)前均未接受化療或放療。

1.2 試劑鼠抗人MGMT抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程公司，S-P-kit試劑盒購(gòu)自上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法免疫組織化學(xué)染色(SP)法：切片脫蠟去水，3%H2O2封閉，一抗4℃反應(yīng)過(guò)夜，二抗室溫孵育20 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，干燥，封片，顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)中以PBS代替一抗做陰性對(duì)照，乳腺癌組織做陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷MGMT蛋白在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中出現(xiàn)顯色顆粒為陽(yáng)性。積分判定：顯微鏡下染色細(xì)胞百分率：＜5%為0分，5%～25%為1分，25%～75為2分，＞75%為3分；染色強(qiáng)度：不顯色或顯色不清晰為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分。綜合積分按照公式計(jì)算：綜合積分=(染色細(xì)胞積分+染色細(xì)胞強(qiáng)度積分)/2；綜合判定：積分＜0.5為“-”(無(wú)表達(dá))，1.0～2.0分為“+”(中等強(qiáng)度表達(dá))，2.0～2.5分為“++”(強(qiáng)表達(dá))，＞2.5分為“+++”(完全表達(dá))。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

癌組與對(duì)照組MGMT蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別為93.33%與42.86%，P＜0.01；MGMT蛋白表達(dá)強(qiáng)度在(+)水平為主，見(jiàn)表1和表2。MGMT蛋白表達(dá)水平與臨床分期有明顯相關(guān)性，P＜0.01，如表3所示。

表1 MGMT蛋白在子宮頸癌及其對(duì)照中的表達(dá)情況

表2 MGMT蛋白在子宮頸癌及其對(duì)照中的表達(dá)

表3 MGMT蛋白表達(dá)與腫瘤臨床分期的關(guān)系

3 討論

研究表明，烷化劑導(dǎo)致突變形成腫瘤的主要機(jī)制主要是能夠在DNA分子鳥(niǎo)嘌呤O6位發(fā)生烷基化，同時(shí)O6鳥(niǎo)嘌呤加合物可與相應(yīng)的胞嘧啶殘基發(fā)生交聯(lián)而封閉DNA復(fù)制。MGMT是一種普遍存在的DNA修復(fù)酶，可以保護(hù)染色體免受烷化劑的致突變作用、致癌作用和細(xì)胞毒性作用損傷，它能將O6鳥(niǎo)嘌呤加合物從DNA上移除，從而在突變前中和這種損傷作用[4]，防止腫瘤的形成。如果MGMT結(jié)構(gòu)和數(shù)目異?；蛉笔?，不能發(fā)揮正常的作用或作用不足，將導(dǎo)致癌基因的激活和抑癌基因的失活，進(jìn)一步發(fā)展形成腫瘤。MGMT結(jié)構(gòu)異常通常表現(xiàn)為MGMT啟動(dòng)子甲基化，目前已在多種癌組織中發(fā)現(xiàn)頻率相當(dāng)高的MGMT啟動(dòng)子過(guò)甲基化和該基因的不表達(dá)[5-7]，MGMT的表達(dá)在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中都有很大的差異，有研究表明MGMT在多種腫瘤中呈高表達(dá)，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并且在不同的組織細(xì)胞內(nèi)分布也不同，MGMT在細(xì)胞漿內(nèi)合成，在細(xì)胞核發(fā)揮作用[8]。關(guān)于MGMT與腫瘤的關(guān)系，有國(guó)外學(xué)者研究認(rèn)為：細(xì)胞的原癌基因一旦發(fā)生突變其產(chǎn)物可能通過(guò)一定的途徑而激活DNA甲基化酶，從而使DNA上的鳥(niǎo)嘌呤在O6位發(fā)生甲基化，導(dǎo)致DNA發(fā)生堿基配對(duì)的錯(cuò)誤(G：C變?yōu)镚：T)，或O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤和對(duì)側(cè)鍵上的胞嘧啶產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)，使復(fù)制難以繼續(xù)，這些異常變化將通過(guò)細(xì)胞分裂周期中的檢驗(yàn)系統(tǒng)激活DNA內(nèi)切酶導(dǎo)致DNA片段化，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡；而MGMT基因甲基化，其表達(dá)的MGMT蛋白會(huì)將已甲基化的DNA鳥(niǎo)嘌呤O6位上的甲基轉(zhuǎn)移到自身的半胱氨酸巰基上，從而使癌細(xì)胞順利通過(guò)細(xì)胞周期監(jiān)測(cè)點(diǎn)，獲得無(wú)限增殖的能力[9]。

有研究顯示，MGMT在肝臟組織中高表達(dá)可抑制烷基致癌物質(zhì)引起的肝腫瘤[10]，提示MGMT表達(dá)與某些腫瘤發(fā)生呈明顯負(fù)相關(guān)。MGMT在宮頸癌的中的表達(dá)情況僅見(jiàn)少量報(bào)道，阿比達(dá)·阿布都卡德?tīng)柕妊芯勘砻鱉GMT在我國(guó)維吾爾族婦女宮頸癌中表達(dá)陽(yáng)性率為84%，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[11]。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)檢測(cè)宮頸癌組織與對(duì)照組MGMT蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中MGMT蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率(93.33%)明顯高于對(duì)照組(42.8%)，但處于低蛋白表達(dá)水平，染色陽(yáng)性強(qiáng)度以(+)為主；子宮頸癌中MGMT表達(dá)增高可能是因?yàn)閷m頸癌宮頸組織中DNA中存在大量甲基化損傷，例如容易受到電離輻射和有毒試劑的誘導(dǎo)而異常表達(dá)，從而導(dǎo)致MGMT蛋白代償性的升高，以此來(lái)修復(fù)這些甲基化損傷。

MGMT表達(dá)水平和腫瘤的分級(jí)及預(yù)后有著明顯的關(guān)系，Matsukura等研究60例肝細(xì)胞癌中的MGMT和Hmlh1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其中7例缺少兩種蛋白，其pTNM分級(jí)明顯高于另25例同時(shí)有這兩種蛋白表達(dá)的病例，并且這7例的預(yù)后較差。胃癌MGMT啟動(dòng)子甲基化與淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤分級(jí)，以及生存期有明顯的相關(guān)性[12]。本研究依據(jù)國(guó)際腫瘤協(xié)會(huì)FIGO 2009修訂的國(guó)際診斷和分期法分期后，發(fā)現(xiàn)早期癌組織MGMT蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比晚期癌組織MGMT蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高，這可能是隨著病情的進(jìn)展，MGMT蛋白表達(dá)的代償性下降所致。本研究表明MGMT蛋白的高表達(dá)與子宮頸癌形成有著密切關(guān)系，并在其不同時(shí)期表達(dá)量明顯不同，因此檢測(cè)MGMT蛋白表達(dá)狀況對(duì)臨床上宮頸癌的診斷、分期、治療有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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Expression and clinical significance of O6-methylguanine DNA methyltransferase in cervical cancer tissues

ZHANG Zhiyong,DENG Rongchun,ZHOU Aiqun,et al.Department of Clinical Laboratory of Jiangxi Provincial People's Hospital,Nanchang 330006,China.

Objective To investigate the expression of O6-methylguanine DNA methyltransferase(MGMT)and its clinical significance in cervical cancer.Methods The expression of MGMT in cervical cancer tissues was detected by immunohistochemistry staining method．Results The expression of MGMT in cervical carcinoma group was higher than that in normal cervical tissues,and the positive rates were 93.33%and 42.8%respectively(P＜0.05).In PhaseⅠandⅡcervical cancer,the expression rates of MGMT (100%and 95.83%respectively)were significantly higher than that in PhaseⅢ-Ⅳcervical cancer(62.5%,P＜0.01).Conclusion MGMT expression level associates with the development process of cervical cancer,its high expression in cervical cancer tissue plays an important role in the diagnosis of cervical cancer.

O6-methylguanine DNA methyltransferase,Cervical cancer;Immunohistochemistry staining

R737.33,R446.8

A

1674-1129(2014)06-0680-03DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.010

2014-07-24；

2014-08-29)

江西省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.20092025、20092026)。作者簡(jiǎn)介：張志勇，男，出生于1979年3月，碩士，主管技師，從事臨床免疫學(xué)相關(guān)研究。

施橋發(fā)，男，出生于1972年8月，博士，副教授，主要從事腫瘤免疫學(xué)治療研究。