分子診斷學技術(shù)在檢驗醫(yī)學中的應(yīng)用及挑戰(zhàn)

方炳雄，翁錫泉，巴艷紅綜述，秦澤鴻審校

(普寧市人民醫(yī)院檢驗科，廣東普寧515300)

·綜述·

分子診斷學技術(shù)在檢驗醫(yī)學中的應(yīng)用及挑戰(zhàn)

方炳雄，翁錫泉，巴艷紅綜述，秦澤鴻審校

(普寧市人民醫(yī)院檢驗科，廣東普寧515300)

隨著基因組學、生物信息學、蛋白質(zhì)組學等多學科的交叉和融合，分子診斷學技術(shù)得到長足的發(fā)展。越來越多的分子診斷學技術(shù)應(yīng)用于疾病的診斷、療效監(jiān)測和預后判斷，這為檢驗醫(yī)學的發(fā)展提供了新的機遇與挑戰(zhàn)。本文就主要的分子診斷學技術(shù)在檢驗醫(yī)學中的應(yīng)用現(xiàn)狀，以及面臨的挑戰(zhàn)進行闡述。

分子診斷學技術(shù)；檢驗醫(yī)學；應(yīng)用；挑戰(zhàn)

DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.018

臨床診斷疾病的手段，一般是通過檢查患者血液、尿液、糞便以及其他分泌物等中的一些生命所需或分泌的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、激素、電解質(zhì)等大小分子的存在與否或含量多少，同時結(jié)合臨床癥狀，來對某種疾病的發(fā)生發(fā)展、診斷預防和治療預后，進行判斷和監(jiān)測[1]。隨著分子生物學和分子遺傳學的發(fā)展，越來越多的分子診斷學技術(shù)應(yīng)用于疾病的診斷，徹底打破常規(guī)的診斷方式，不再以疾病的表型為主要依據(jù)推測疾病的發(fā)生發(fā)展及相關(guān)機制。分子診斷學技術(shù)，通過檢測遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達水平，不但發(fā)現(xiàn)了疾病與特定基因存在、轉(zhuǎn)錄及表達有關(guān)，而且個體基因多態(tài)性與疾病特定用藥密切相關(guān)。分子診斷，更注重個體基因差異，不僅對患者所患疾病做出判斷，也可以對表型正常的攜帶者或特定疾病的易感人群做出預測。分子生物學技術(shù)在檢驗醫(yī)學中的應(yīng)用，為個性化醫(yī)療提供技術(shù)保障，降低患者的疾病治療成本，減輕社會公共衛(wèi)生負擔。分子診斷學技術(shù)有力地推動了檢驗醫(yī)學在疾病診斷和預后方面的發(fā)展，為人們作出高質(zhì)量的分子診斷檢測服務(wù)[2，3]。

1 常用的分子診斷技術(shù)

1953年Watson和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，并在此基礎(chǔ)上提出中心法則，描述遺傳信息從基因到蛋白質(zhì)的流動，標志著分子生物學作為一個獨立學科的誕生?？v觀分子診斷60年的發(fā)展歷史，分子診斷學技術(shù)大致分為三大方面：分子雜交技術(shù)、基因擴增技術(shù)和基因測序技術(shù)。分子診斷學技術(shù)具有自動化、快速化、準確化等特點，在疾病的診斷、治療、預后方面發(fā)揮越來越重要的作用[4]。

1.1 分子雜交技術(shù)分子雜交是指具有同源序列的兩條核酸單鏈，在一定條件下按照堿基互補配對原則形成雙鏈的過程。上世紀60年代開始，雜交技術(shù)得到迅猛的發(fā)展，能夠通過已知基因序列的探針對靶序列進行捕獲檢測。主要技術(shù)有菌落原位雜交、斑點雜交、Southern印跡、Northern印跡、熒光原位雜交、芯片雜交等[2,4]。

原位雜交技術(shù)是利用堿基互補配對的原則，將靶基因在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來。1975年Southern發(fā)明了DNA印跡技術(shù)，該方法利用DNA片段酶切和分子探針雜交技術(shù)，保證檢測的特異性[5]。目前，Southern印跡法仍為探針雜交領(lǐng)域最經(jīng)典的分子檢測方法，在基因突變的檢測方面廣為應(yīng)用。1977年Rudkin使用熒光素標記探針，發(fā)明了熒光原位雜交，使得原位雜交技術(shù)準確性更高，靈敏度更強[6]。原位雜交技術(shù)主要應(yīng)用于基因定位、癌癥基因檢測和判斷等方面。

1991年Affymetrix公司的Fordor研發(fā)了光蝕技術(shù)，制備了首個以玻片為載體的微陣列，標志著芯片技術(shù)正式成為可實際應(yīng)用的分子生物學技術(shù)?；蛐酒?，又稱DNA微陣列，是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列在載體表面，通過核酸雜交原理，用于檢測DNA序列的新工具[7]?；蛐酒夹g(shù)具有高通量、高靈敏度、微型化、自動化等特點，在單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)檢測、產(chǎn)前診斷、藥物篩選等均有應(yīng)用。

1.2 基因擴增技術(shù)1983年美國Cetus公司的Mullis發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction,PCR)，該技術(shù)利用DNA高溫變性和低溫復性的原理，通過變性、復性和延伸3個溫度變化，成功實現(xiàn)核酸片段的體外擴增。PCR技術(shù)以其特異性高、靈敏度高、簡便、快速，對標本的純度要求低等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用到醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、食品檢驗等領(lǐng)域[1]。

PCR技術(shù)分為兩種：常規(guī)PCR技術(shù)和實時PCR技術(shù)。常規(guī)PCR技術(shù)，指僅對PCR擴增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進行定性或半定量分析，無法對起始模板準確定量，也無法對擴增反應(yīng)實時檢測的一項核酸擴增技術(shù)，但該技術(shù)所需技術(shù)平臺和儀器設(shè)備較低，花費成本相對也低，目前臨床上主要運用該平臺對定性項目進行檢測，例如：缺失基因、突變基因、融合基因等的檢測。實時PCR技術(shù)，又稱實時定量熒光PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的技術(shù)。實時PCR技術(shù)，具有特異性強、準確度高、重復性好等特點，在檢驗醫(yī)學上主要應(yīng)用于核酸定量、mRNA表達水平分析等，可以分析和指導臨床用藥、監(jiān)測藥物療效、判斷病情進展[2]。

1.3 基因測序技術(shù)1977年Maxam提出了化學修飾降解法模型，為核酸測序時代的到來拉開序幕[8]。同年，Sanger等發(fā)明了DNA雙脫氧鏈末端終止法，可以檢測物種或細胞的核酸序列，再與基因庫進行比對，從而知道被檢測物種或細胞的特性。Sanger法作為最經(jīng)典的測序方法，讀取序列長，能夠較好地處理重復序列和多聚體，仍為目前常用的測序方法，廣泛應(yīng)用于基因組DNA、cDNA等多重復序列的檢測。該技術(shù)不足之處：靈敏度較低，通量較低。

1998年Ronaghi發(fā)明了焦磷酸測序法，其基本原理是利用引物延伸時所釋放的焦磷酸基團激發(fā)熒光，通過峰值高低判斷與其匹配的堿基數(shù)量[9，10]。比起Sanger法，提高了靈敏度，在SNP位點檢測、等位基因突變測定等廣泛運用。

近幾年，發(fā)明了高通量測序技術(shù)，是對傳統(tǒng)技術(shù)的一次革命性的創(chuàng)新。該技術(shù)通過DNA片段化構(gòu)建DNA文庫、文庫與載體交聯(lián)進行擴增、在載體面上進行邊合成邊測序反應(yīng)，完成對海量數(shù)據(jù)的高通量測序。該技術(shù)測序速度快、準確度高，可以進行大規(guī)模的測序檢測，主要應(yīng)用于全基因組序列、內(nèi)含子序列、外顯子序列等的分析和研究[11]。

2 分子診斷學技術(shù)在檢驗醫(yī)學中的應(yīng)用

分子診斷就是應(yīng)用分子生物學技術(shù)，在遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達水平，通過檢測特定基因存在、轉(zhuǎn)錄及表達異常，對人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法。分子診斷學在檢驗醫(yī)學中的應(yīng)用，使越來越多的疾病的發(fā)生發(fā)展的分子機制得到闡明，為臨床醫(yī)生對疾病的診斷、治療和預后，提供最為直接、最為準確的依據(jù)。目前分子診斷學技術(shù)在感染性疾病和遺傳性疾病中的應(yīng)用最為廣泛。

2.1 分子診斷學技術(shù)在感染性疾病的應(yīng)用感染性疾病是指外源病原體入侵機體后，生物體無法排除該病原體而產(chǎn)生一系列不適的反應(yīng)。一般通過病原體培養(yǎng)或血清學方法進行病因查找。酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)是目前檢驗醫(yī)學實驗室檢測免疫學指標應(yīng)用最廣泛的方法之一，廣泛應(yīng)用于乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋病等感染性疾病的診斷檢測和診斷，具有靈敏度高、特異性強、快速簡便等優(yōu)點，但是一些影響因素不容小覷，臨床待檢標本常受溶血、黃疸、脂濁等因素的影響，導致檢測結(jié)果判斷錯誤[12]。血清學也只能確定機體是否接觸病原體，不判斷是否是現(xiàn)行感染。PCR和基因芯片技術(shù)應(yīng)用于病原微生物的檢測，具有敏感性高、耗時少、效率高等優(yōu)點[3]。例如：利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測乙肝病毒DNA的載量，與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法相比，既可以提示疾病的嚴重程度，也可以監(jiān)測藥物療效、預后與復發(fā)。分子診斷學技術(shù)在感染性疾病的應(yīng)用，可彌補血清學檢測技術(shù)的缺陷，主要包括以下幾個方面：(1)檢查不能培養(yǎng)或生長緩慢的病原微生物；(2)通過病原微生物的定量檢查監(jiān)測病情；(3)微生物耐藥性的檢查；(4)細菌分型及流行病學調(diào)查。

2.2 分子診斷學技術(shù)在遺傳性疾病中的應(yīng)用遺傳性疾病是指遺傳因素占主要發(fā)病原因的某些疾病，幾乎都存在一定的基因缺失或突變。分子診斷學技術(shù)是指通過分析患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達水平的變化，對人體健康狀態(tài)和疾病作出或輔助診斷的方法。分子診斷學技術(shù)已經(jīng)能夠診斷已知致病基因的遺傳性疾病，對一些基因突變所致的遺傳病也有良好的診斷意義，也能利用遺傳標志來診斷一些病因未明的疾病[13]。例如，鐮狀細胞貧血：β-珠蛋白基因中第6位密碼子的序列由原來的GAG改變?yōu)镚TG，編碼的血紅蛋白為鐮狀細胞血紅蛋白。通過PCR技術(shù)可以將包含突變位點的β-珠蛋白基因片段擴增，根據(jù)產(chǎn)物分析的結(jié)果可以對該遺傳性疾病進行診斷?；诨蛐酒夹g(shù)，對基因SNP進行分型，檢測遺傳性耳聾基因，發(fā)現(xiàn)50%的兒童期耳聾與遺傳因素有關(guān)[14]。采用序列特異性引物聚合酶反應(yīng)(polymerase chain reaction with sequence specific primer,PCR-SSP)技術(shù)對白介素18基因啟動子區(qū)-607C/A、-137G/C基因型多態(tài)性進行分析，從而發(fā)現(xiàn)該基因啟動子區(qū)-607C/A、-137G/C多態(tài)性與江西人群哮喘未見相關(guān)性[15]。利用高通量測序技術(shù)，結(jié)合生物信息學，可以準確預測胎兒發(fā)生某些遺傳性疾病的風險，從而達到降低畸形兒出生率的目的，例如：21-三體綜合征(唐氏綜合征)、18-三體綜合征(愛德華綜合征)等。

3 現(xiàn)狀和挑戰(zhàn)

分子診斷以PCR為基礎(chǔ)，自從發(fā)明以來，廣泛地應(yīng)用于疾病診斷、療效檢測和預后判斷，有力推動了檢驗醫(yī)學的發(fā)展，開辟了檢驗醫(yī)學的新領(lǐng)域，給檢驗醫(yī)學帶來機遇與挑戰(zhàn)。在美國和歐洲等發(fā)達國家，分子診斷已經(jīng)成為了醫(yī)療診斷不可或缺的重要組成部分，為人民的健康保駕護航發(fā)揮重要的作用。國內(nèi)的分子診斷學技術(shù)在檢驗醫(yī)學中的應(yīng)用，雖取得一定程度的發(fā)展，但是始終落后臨床的發(fā)展，難以滿足臨床診斷的要求，分子診斷項目開展較少，重視程度不夠，應(yīng)用緩慢[16，17]。以下從兩方面分析我國分子診斷學技術(shù)應(yīng)用于檢驗醫(yī)學的現(xiàn)狀及存在的問題。

3.1 分子診斷檢測平臺現(xiàn)在檢驗醫(yī)學的發(fā)展方向是自動化和一體化，分子診斷學技術(shù)努力實現(xiàn)檢測儀器、試劑和校準品的一體化，從而避免實驗室之間結(jié)果的差異。我國的分子診斷在檢驗醫(yī)學中的應(yīng)用平臺，還處在起步階段，實現(xiàn)自動化尚需時日。目前我國在核酸提取、擴增反應(yīng)系統(tǒng)準備、擴增前加樣、上機、產(chǎn)物和結(jié)果分析等方面仍是以手工操作為主。歐美國家基本上采用自動化核酸提取系統(tǒng)，既可以提高工作效率，減少生物暴露時間，還避免操作人員個體差異對實驗結(jié)果的影響，提高結(jié)果的可重復性和準確性。目前我國應(yīng)用于檢驗醫(yī)學的主流分子診斷學技術(shù)是實時熒光PCR技術(shù)，主要用于感染性疾病病原體核酸的檢測，而歐美發(fā)達國家，檢測平臺較為多樣，主流技術(shù)為測序，分子診斷涵蓋了感染性疾病、遺傳性疾病、腫瘤等領(lǐng)域。

3.2 技術(shù)人員的水平與能力分子診斷檢驗項目質(zhì)量控制涵蓋多個方面，包括分析前、分析中、分析后的各個層面，因此對技術(shù)人員、儀器、標本、環(huán)境要求更加嚴格。目前我國對分子診斷學技術(shù)人員的培訓尚不到位，技術(shù)人員在實驗操作、結(jié)果報告、臨床咨詢方面尚有很多不足之處。隨著人們對人類基因組功能研究的深入，人們對生命、疾病、衰老、死亡的認識更深。分子診斷涉及個體的基因差異，要求相關(guān)技術(shù)人員能夠提出專業(yè)的意見，指導預防疾病、降低患病風險，以及實現(xiàn)個性化治療等，這就對從事分子診斷學技術(shù)的工作人員的水平和素質(zhì)提出更高的要求。

4 前景和展望

在國際上，越來越多的分子診斷學技術(shù)應(yīng)用于檢驗醫(yī)學，國內(nèi)檢驗醫(yī)學界也越來越重視和發(fā)展分子診斷技術(shù)，并取得一定的成績。但是，無論是分子診斷學技術(shù)在檢驗醫(yī)學中的應(yīng)用平臺，還是從事分子診斷技術(shù)人員的能力，以及相關(guān)的管理規(guī)范，與國外先進技術(shù)或管理比較，都處在落后的局面。希望通過檢驗醫(yī)學界同仁共同努力，規(guī)范管理分子診斷的開展，引進和培訓分子診斷技術(shù)人員，縮短與國外先進水平的差距，為疾病的診斷、療效檢測和預后判斷，作出高質(zhì)量的分子診斷檢測。

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Q52,R466

A

1674-1129(2014)06-0700-03

2014-07-09；

2014-08-27)

方炳雄，男，1985年2月出生，碩士學位，檢驗師，研究方向為臨床分子診斷。