基于IC50的醫(yī)療器械細胞毒性試驗方法的研究

劉成虎，吳世福，侯 麗，王 昕，王鸞鸞，施燕平

1 山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質量檢驗中心，濟南市，250101

2 山東省醫(yī)療器械生物學評價重點實驗室，濟南市，250101

基于IC50的醫(yī)療器械細胞毒性試驗方法的研究

【作者】劉成虎1,2，吳世福1,2，侯 麗1,2，王 昕1,2，王鸞鸞1,2，施燕平1,2

1 山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質量檢驗中心，濟南市，250101

2 山東省醫(yī)療器械生物學評價重點實驗室，濟南市，250101

針對ISO 10993-5:2009中規(guī)定的MTT法的振動條件和觀察終點進行研究，并對IC50在MTT法結果評價中的應用情況進行

醫(yī)療器械；細胞毒性；MTT法；IC50

細胞毒性試驗作為一種常用的體外篩選試驗，因其具有試驗周期短，試驗結果重復性好等優(yōu)點，是醫(yī)療器械生物安全性評價中最常用的檢查項目。通過細胞毒性篩查試驗，可以為其他生物學危險源的識別和評估提供初步證據(jù)。ISO 10993-5:2009是國際標準化組織制定的最新版本醫(yī)療器械細胞毒性試驗標準。該標準中將醫(yī)療器械細胞毒性試驗方法分為直接接觸試驗、間接接觸試驗和浸提液試驗三大類。其中浸提液試驗的結果判定又詳細分為顯微鏡觀察定性評價法和定量評價法。定性評價采用分級評價方法，定量評價中規(guī)定細胞活性下降大于30%被認為有細胞毒性反應[1]。ISO 10993-5:2009標準在附錄中給出定量評價的四個具體方法學示例。其中，MTT法是目前采用比較廣泛的方法。但是作為體外試驗，諸多因素，如樣品制備方法、細胞接種濃度、觀察終點和試驗條件等都會影響MTT法的實驗結果，針對該實驗影響因素的研究也一直存有爭議[2-3]，并且ISO 10993-5:2009中在該方法的細節(jié)描述上也不盡詳細。因此，本研究中首先選用某些醫(yī)療器械中含有的可溶性銀離子作為研究對象，對ISO 10993-5:2009中規(guī)定的MTT法的振動條件和觀察終點進行驗證，以期找出影響該試驗的關鍵性因素。

目前，ISO/TC194已經(jīng)組織對ISO 10993-5:2009進行修訂，新修訂的草案稿中又增加了對定量評價法的分級評價標準，并在定量評價中引入IC50（細胞活性50%抑制濃度）的概念。雖然ISO 10993-5:2009在方法示例中提到了IC50，但尚未將其用于MTT法測定醫(yī)療器械細胞毒性的結果分級評價中。新標準的發(fā)布，將會對目前細胞毒性試驗結果的評價產(chǎn)生較大影響。因此，本文針對IC50在MTT法結果評價中的應用情況進行探討，以期為新標準的制修訂積累相應的驗證資料。

1 材料與方法

1.1 細胞系

L929細胞系購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。原種細胞解凍后，在試驗之前傳代2次～3次。細胞接種至96孔板后，維持培養(yǎng)24 h（約1倍周期），至形成半融合單層用于試驗。

1.2 試劑和器具

MTT(Sigma公司)，溶于不含酚紅的MEM中，濃度為1 mg/mL，溶液采用過濾器(孔徑≤0.22 μm)經(jīng)無菌過濾法除菌，過濾后當天使用；MEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)。倒置顯微鏡(Olympus TH4-200)，快速細胞分析儀(CASY-TT 德國Innovatis AG)，全自動酶標儀(Thermo Multiskan MK3)。

1.3 試驗樣品及處理

AgNO3粉末購自Sigma公司，CAS 號：7761-88-8。陰性對照產(chǎn)品高密度聚乙烯和陽性對照含有二乙基二硫代氨基甲酸鋅的聚氨酯膜（SPU-ZDEC）均購自日本Hatano Research Institute。先將AgNO3溶于無菌蒸餾水中，然后用MEM完全培養(yǎng)基稀釋至由預實驗確定的5 μg/mL、4.5 μg/mL、3.5 μg/mL、2.5 μg/mL共4個試驗濃度。陽性對照組選取MEM完全培養(yǎng)基為浸提介質，按照0.1 g/mL的比例，在37±1oC 60 r/min 水平振搖的條件下浸提24±2 h來制備浸提液，再以100%浸提液的1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%和8%共8個系列稀釋濃度進行試驗。陰性對照選取MEM完全培養(yǎng)基為浸提介質，按照0.1 g/mL的比例，在37±1oC的條件下浸提24±2 h，制備浸提液。

1.4 試驗分組

試驗共分為以下5組：

(1) 空白對照（不含細胞的培養(yǎng)液對照）；

(2) 浸提介質對照組（VC，細胞平均活力為100%）；

(3) 陽性對照組 細胞+不同稀釋度的SPU-ZDEC浸提液；

(4) 試驗組 細胞+不同濃度AgNO3溶液；

(5) 陰性對照組 細胞+高密度聚乙烯浸提液。

1.5 試驗步驟

按ISO 10993-5：2009中附錄C的要求，用MTT法進行體外細胞毒性試驗。

試驗中分別設置孵育24 h和48 h兩個試驗觀察終點，同時設置30 s、60 s和90s中速振蕩三種不同的振動平板的條件，通過試驗結果之間的比較得出最佳的試驗條件。最終在該條件下以標準中的定量法計算出AgNO3溶液和SPU-ZDEC的IC50值，并將其與定性結果RGR(%)相關聯(lián)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

按下式比較計算存活率：

式中：OD570e—試驗樣品100%浸提液光密度平均值；OD570b—浸提介質對照光密度平均值。

ISO 10993-5：2009修訂草案中擬加入的結果定量評價如表1所示。

表1 定量試驗細胞毒性分級Tab.1 Grading of the extent of cytotoxicity in quantitative tests

當細胞測定終點大于浸提原液（100%）的70%時，可判定為無細胞毒性；當小于70%時，則需要對浸提液進行至少4個以上的系列梯度稀釋來計算相應的IC50值，根據(jù)IC50值對應的細胞反應程度來判定細胞毒性。

2 結果

2.1 不同振動條件和觀察終點對試驗結果的影響

ISO 10993-5：2009中推薦至少孵育24 h的觀察終點，并在檢測吸光度值前應對96孔板進行振動，但是沒有規(guī)定具體的振動條件，本研究中我們分別選取中速振動30 s、60 s和90 s共3個振動條件對孵育24 h和48 h兩個試驗終點進行觀察，見圖1。結果表明，應用標準中推薦的異丙醇作為溶劑，圖1(a)和圖1(b)中隨著振動時間延長，各組細胞的OD值都有所升高，后續(xù)實驗表明90 s后趨于平穩(wěn)。因此，中速振動的最佳振動時間應介于30 s和90 s之間。同時，隨著觀察終點時間的延長，雖然各組細胞OD值都有一定程度增加，但各組別之間無顯著性差異。

圖1 不同振動條件對試驗結果的影響Fig. 1 Effect of different vibrating conditions on test results

2.2 應用IC50法評價MTT 法試驗結果

IC50值為細胞活性抑制50%時抑制劑的濃度，一般用于評價單一化合物的細胞毒性反應，醫(yī)療器械浸提液多為混合物，因此需要對其適用性進行驗證。為了研究IC50計算法在MTT法細胞毒性試驗中應用的可行性，我們分別選取不同濃度的AgNO3溶液和SPU-ZDEC浸提液進行試驗，測定OD值，見圖2(a)和圖2(b)，分析各組細胞的OD值變化情況，用存活率公式計算各組細胞生長抑制率，根據(jù)文獻中推薦的IC50軟件公式來計算相應的IC50值[4]。結果顯示：AgNO3溶液的IC50值為4.5 μg/mL，SPU-ZDEC浸提液的IC50值為3.1%，見圖2（c）。

圖2 用IC50評價AgNO3和SPU-ZDEC浸提液對細胞活力的影響Fig.2 Effect of IC50on cell viability evaluation of AgNO3and SPU-ZDEC extract

2.3 定性法測定細胞毒性試驗結果

按ISO 10993-5：2009中附錄C的要求采用浸提液接觸法進行細胞毒性試驗，顯微鏡下顯示，浸提介質對照組和陰性對照組細胞生長繁殖旺盛，形態(tài)良好，見圖3(a)和圖3(b)。陽性對照組(100%浸提原液)的細胞在48 h內(nèi)100%細胞發(fā)生圓縮死亡，見圖3(c)。4.5 μg/mL 的AgNO3溶液細胞生長情況見圖3(d)，定性評價的結果介于輕度和中度之間(見表2)。

圖3 顯微鏡觀察AgNO3和SPU-ZDEC浸提液的細胞毒性Fig.3 Cytotoxicity of AgNO3and SPU-ZDEC extract by microscopical determination

3 討論

醫(yī)療器械細胞毒性試驗中試驗樣品的選擇會顯著影響試驗結果。本研究中選用含銀敷料產(chǎn)品中存在一定程度細胞毒性反應的銀離子作為研究對象。雖然含銀敷料的細胞毒性受到敷料中銀的存在狀態(tài)、銀的含量、銀離子的釋放速率及方式等多因素的影響[5]，但基于含銀敷料中的銀多以銀離子的形式發(fā)揮抗菌作用，因此選用醫(yī)療器械中存在的可溶性銀離子作為研究對象符合試驗要求。

ISO 10993-5:2009中規(guī)定了在測定吸光度前需對平板進行振蕩，但沒有規(guī)定具體的振動幅度和振動時間。我們針對振動條件的驗證表明，采用異丙醇作為溶劑，介于30 s和90 s之間的中速振蕩是比較適宜的振動條件。在觀察終點的研究上，我們分別選用24 h和48 h兩個觀察終點。研究表明，隨著觀察終點時間的增加，細胞吸光度值有所增加，考慮主要是因為細胞正常增殖導致（見圖1）。但我們在實際選用觀察終點時，仍應根據(jù)試驗樣品的特性，與人體的接觸程度和接觸時間，并結合細胞具體的生長情況來確定孵育時間。

IC50在細胞毒性試驗中的應用多見于針對單一化學物質的研究，也有學者將其用于醫(yī)療器械細胞毒性試驗中標準參照材料的選擇[6]。本研究中，我們通過細胞毒性試驗計算出銀離子的IC50值為4.5 μg/mL（見圖2），并用該濃度的銀離子進行結果的定性評價（見表2）。結果表明，定量分級評價與定性評價之間具有良好的相關性。為了進一步驗證標準草案中的定量分級評定方法，我們對陽性對照的100%浸提液梯度稀釋液進行試驗，計算出SPU-ZDEC浸提液的IC50值為3.1%，與定性評價結果一致。這些結果都表明，將IC50值作為ISO 10993-5：2009中結果定量分級評價是可行的。

我國尚未轉化國際標準ISO 10993-5：2009。實際上，該標準也存在諸多不完善的地方。例如，該標準附錄中所規(guī)定的四個定量檢測方法分別有著不同的靈敏度，同一試驗樣品，選用不同的方法可能會得到不同的試驗結果，因此，如何結合產(chǎn)品的特性進行方法選擇。ISO 10993-5：2009的修訂稿在試

表2 定性法評價AgNO3和SPU-ZDEC浸提液的細胞毒性Tab.2 Cytotoxicity of AgNO3and SPU-ZDEC extract by qualitative evaluation

驗結果的定量評價中雖然引入了IC50的概念，但并未給出具體的計算方法，因此，如何選用統(tǒng)一的軟件計算IC50值等這些問題都需要在新標準的修訂中解決，這也是我們在采用該國際標準時需要關注的問題。

[1] ISO 10993-5:2009 醫(yī)療器械生物學評價 第5部分：體外細胞毒性試驗[S].

[2] 楊浩, 王春婷, 吳玉梅, 等，MTT試驗中細胞特性狀態(tài)及細胞數(shù)與OD值的關系探討[J].動物醫(yī)學進展, 2002, 23(5): 49-51.

[3] 李麗, 周建平, 胡宇馳. 細胞濃度和作用時間對細胞毒性檢查法影響的探討[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2012, 18(14): 101-104.

[4] MHLW Basic principles of biological safety evaluation required for application for approval to market medical devices[R]. 2012, 33.

[5] Lansdown ABG. A review of silver in wound care: facts and fallacies[J]. Br J Nurs, 2004, 13 (6 Suppl): 6-19.

[6] Toshie T, Yoshiaki I, Hideyo H, et al. Comparative studies of the toxicity of standard reference materials in various cytotoxicity tests and in vivo implantation tests[J]. J Appl Biomater, 1993, 4(2): 153-156.

Study on Cytotoxicity Tests of Medical Devices Based on IC50

【W(wǎng)riters】Liu Chenghu1,2, Wu Shifu1,2, Hou Li1,2, Wang Xin1,2, Wang Luanluan1,2, Shi Yanping1,2
1 Shandong Quality Inspection Center for Medical Devices, Jinan, 250101
2 Shandong Key Laboratory of Biological Evaluation for Medical Devices, Jinan, 250101

To discuss IC50application in cytotoxicity tests of medical devices, we frstly investigated the vibrating condition and endpoint of MTT method specifed in ISO 10993-5: 2009. Furthermore, we demonstrated the application of IC50in the result evaluation of MTT method. The experimental results show that usage of IC50in quantitative evaluation of MTT method is feasible.

medical device, cytotoxicity, MTT method, IC50

R197.39

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2014.06.012

1671-7104(2014)06-0433-03

2014-02-20

十二五國家科技支撐計劃課題 (2012BAI22B01)

劉成虎，E-mail: liuchenghu510@163.com

探討。研究表明，將IC50用于MTT法試驗結果的定量分級評價是可行的。