雙縮脲試劑在檢測(cè)蛋白質(zhì)上的應(yīng)用研究

陳寧清，鄭司雨

1 浙江省醫(yī)療器械研究所，杭州市，310009

2 華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海市，200237

雙縮脲試劑在檢測(cè)蛋白質(zhì)上的應(yīng)用研究

【作者】陳寧清1，鄭司雨2

1 浙江省醫(yī)療器械研究所，杭州市，310009

2 華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海市，200237

目的 探討雙縮脲試劑在檢測(cè)蛋白質(zhì)應(yīng)用中，不同檢測(cè)條件對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響。方法 采用雙縮脲法，選取三種不同儀器、試劑、校準(zhǔn)物進(jìn)行排列組合，組成27套檢測(cè)系統(tǒng)，每個(gè)檢測(cè)組合系統(tǒng)對(duì)5分樣本血清進(jìn)行檢測(cè)，得到5個(gè)測(cè)定值，以全部血清總蛋白的測(cè)定值剔除離群值后得出的均值，以此計(jì)算出各個(gè)檢測(cè)組合系統(tǒng)運(yùn)用雙縮脲試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)的偏倚。結(jié)果不同檢測(cè)儀器運(yùn)用雙縮脲試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)的偏倚，方差齊性(P=0.467)，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.688，P=0.421)；不同檢測(cè)試劑運(yùn)用雙縮脲試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)的偏倚，方差齊性(P=0.574)，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.784，P=0.011)；不同校準(zhǔn)物運(yùn)用雙縮脲試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)的偏倚，方差齊性(P=0.467)，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.289，P=0.000)。結(jié)論雙縮脲試劑在檢測(cè)蛋白質(zhì)應(yīng)用中，檢測(cè)試劑和校準(zhǔn)物會(huì)對(duì)測(cè)試結(jié)果產(chǎn)生影響，在進(jìn)行試驗(yàn)比對(duì)的時(shí)候，有必要對(duì)檢測(cè)試劑和校準(zhǔn)物造成的檢測(cè)偏差進(jìn)行考慮。

雙縮脲；總蛋白；影響因素

0 引言

血清中含量最多的就是血清總蛋白(TP)，血清總蛋白包括白蛋白以及球蛋白兩大類。它具有維持血管內(nèi)正常膠體滲透壓和酸堿度、運(yùn)輸多種代謝物、調(diào)節(jié)被運(yùn)輸物質(zhì)的生理作用等多種功能，同時(shí)它還可以反映我們機(jī)體的免疫狀況。在臨床中對(duì)于血清總蛋白檢測(cè)可以了解我們身體的營(yíng)養(yǎng)狀況、肝臟合成功能、腸道情況、腎臟病變等等，根據(jù)血清總蛋白檢測(cè)結(jié)果醫(yī)生結(jié)合其他臨床資料就可以對(duì)某些疾病做出診斷。

血清總蛋白測(cè)定目前常抽取靜脈血采用雙縮脲比色法測(cè)定，它是目前首先推薦的蛋白質(zhì)定量方法。此法的原理是蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下與二價(jià)銅離子(Cu2+)作用生成藍(lán)紫色的化合物，這種顏色反應(yīng)強(qiáng)度在一定濃度范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)含量成正比，經(jīng)與同樣處理的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液比較，即可求得蛋白質(zhì)含量。此反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)是清、球蛋的反應(yīng)性相近，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，干擾物質(zhì)少，為首選的常規(guī)方法。但是其也存在靈敏度較差，精度不高的問題。由于目前各醫(yī)院采用的檢測(cè)設(shè)備、試劑以及校準(zhǔn)物是不一樣的。特別是不同生產(chǎn)廠家出品的雙縮脲試劑盒其組分不同，因此其吸光度也不一樣[1]。浙江省體外診斷試劑公共服務(wù)平臺(tái)在產(chǎn)品檢測(cè)過程中，有必要對(duì)這些因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響做出評(píng)價(jià)，從而就我們的檢測(cè)條件進(jìn)行改進(jìn)，制定出統(tǒng)一的指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)，這有利于我們對(duì)雙縮脲試劑在檢測(cè)蛋白質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，便于醫(yī)生對(duì)疾病作出正確的診斷。

1 資料與方法

1.1 材料

(1) 樣本血清的來源 每日常規(guī)工作后收集新鮮血清27份，制備成5份不同濃度的混合血清，分裝于帶蓋的清潔試管內(nèi)，共135份。

(2) 檢測(cè)儀器 本次實(shí)驗(yàn)采用三種檢測(cè)儀器，參考目前臨床應(yīng)用情況，選取應(yīng)用較為廣泛的三種檢測(cè)儀器，本次檢測(cè)儀器選取HI-TACHI-7060全自動(dòng)生化分析儀、OLYMPUS AU400全自動(dòng)生化分析儀、ADVIA1800全自動(dòng)生化分析。

(3) 檢測(cè)試劑 本次實(shí)驗(yàn)選取三種檢測(cè)試劑，參考目前臨床應(yīng)用情況，選取應(yīng)用較為廣泛的三種檢測(cè)試劑，本次檢測(cè)試劑選取中生北控、四川邁克、羅氏三個(gè)品牌。

(4) 校準(zhǔn)物 本次實(shí)驗(yàn)選取三種校準(zhǔn)物，參考目前臨床應(yīng)用情況，選取應(yīng)用較為廣泛的三種校準(zhǔn)物，本次檢測(cè)校準(zhǔn)物選取邁瑞、重慶百克、科華生物三個(gè)品牌。

1.2 方法

檢測(cè)方法采用雙縮脲法，三種不同儀器、試劑、校準(zhǔn)物進(jìn)行排列組合，組成27套檢測(cè)系統(tǒng)，每個(gè)檢測(cè)組合系統(tǒng)對(duì)5分樣本血清進(jìn)行檢測(cè)，得到5個(gè)測(cè)定值，一共135份檢測(cè)結(jié)果。選擇處理后正態(tài)性較好的一份血清作為研究對(duì)象，測(cè)定值與靶值(全部AST的測(cè)定值剔除離群值后得出的均值)之差除以靶值，即為偏倚，分別計(jì)算出各個(gè)檢測(cè)組合系統(tǒng)運(yùn)用雙縮脲試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)的偏倚，先用SPSS18.0軟件按檢測(cè)儀器、檢測(cè)試劑和檢測(cè)校準(zhǔn)物所得到的偏倚進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），從而確定影響雙縮脲試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)果的因素。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)儀器對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

對(duì)HI-TACHI-7060全自動(dòng)生化分析儀、OLYMPUS AU400全自動(dòng)生化分析儀、ADVIA1800全自動(dòng)生化分析三組不同檢測(cè)儀器的135份檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析：不同檢測(cè)儀器運(yùn)用雙縮脲試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)的偏倚，方差齊性(P=0.467)，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.688，P=0.421)，詳見表1。

表1 不同檢測(cè)儀器對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響Tab.1 Effects of different detection instruments on testing results

2.2 檢測(cè)試劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

對(duì)中生北控、四川邁克、羅氏三個(gè)品牌三種不同品牌的135份檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析：不同檢測(cè)試劑運(yùn)用雙縮脲試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)的偏倚，方差齊性(P=0.574)，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.784，P=0.011)，詳見表2。

表2 不同檢測(cè)試劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響Tab.2 Effects of different detection reagents on testing results

2.3 校準(zhǔn)物對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

對(duì)邁瑞、重慶百克、科華生物三種不同校準(zhǔn)物品牌的135份檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析：不同校準(zhǔn)物運(yùn)用雙縮脲試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)的偏倚，方差齊性(P=0.467)，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.289，P=0.000)，詳見表3。

表3 不同校準(zhǔn)物對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響Tab.3 Effects of different methods of calibration on testing results

3 討論和結(jié)論

目前，血清中蛋白質(zhì)的檢測(cè)在臨床中已得到廣泛運(yùn)用，血清中蛋白質(zhì)增高常見于脫水、血液濃縮和多發(fā)性骨髓瘤。血清中蛋白質(zhì)減低常見于血漿水分增加、肝功能障礙、消耗性疾病、營(yíng)養(yǎng)不良、廣泛燒傷、腎病綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、大量反復(fù)放胸腔積液和腹水等。因此，血清中蛋白質(zhì)的檢測(cè)是醫(yī)生對(duì)疾病診斷、治療觀察、判斷預(yù)后的重要手段，血清總蛋白測(cè)定結(jié)果對(duì)疾病的診斷雖然不具有一定的特異性，但在臨床中可以結(jié)合其他資料來對(duì)疾病情況進(jìn)行診斷，因此血清中蛋白質(zhì)的檢測(cè)值的準(zhǔn)確性和一致性十分重要[2]。目前，雙縮脲法是全國(guó)臨床檢驗(yàn)血清總蛋白的常規(guī)方法，因此，拋開檢測(cè)方法影響血清總蛋白檢測(cè)結(jié)果的實(shí)驗(yàn)環(huán)境就包括檢測(cè)儀器、試劑以及校準(zhǔn)物等[3-4]。從實(shí)際情況也可以看出，雙縮脲法在各家醫(yī)院應(yīng)用的統(tǒng)一性比較強(qiáng)，因此本研究重點(diǎn)分析雙縮脲法在檢測(cè)蛋白質(zhì)應(yīng)用中影響其檢測(cè)結(jié)果的檢測(cè)器材、試劑以及校準(zhǔn)物。目前，全國(guó)各地經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平不一樣，存在城鄉(xiāng)差距，各醫(yī)院的條件存在差距，因此使用的儀器、試劑、校準(zhǔn)物也一樣。從使用的儀器來看，大多數(shù)醫(yī)院采用的分析儀都是奧林巴斯AU系列、日立HI-TACHI系列，這些分析儀等都經(jīng)過一定的性能評(píng)定，有的經(jīng)ISO/15189認(rèn)定，系統(tǒng)誤差會(huì)很小，偏倚值也不大，而本次研究也證明了這一點(diǎn)[5]。目前檢測(cè)系統(tǒng)中試劑及試劑盒占有比較重要的地位，對(duì)結(jié)果影響較大，如比較好的試劑羅氏原裝試劑，在實(shí)驗(yàn)室分析統(tǒng)計(jì)中常作為參照標(biāo)準(zhǔn)以評(píng)價(jià)其它試劑的質(zhì)量，但受當(dāng)前醫(yī)療水平的限制，大小醫(yī)院使用的試劑參差不齊，沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。目前，各實(shí)驗(yàn)室不斷引進(jìn)新的儀器和檢驗(yàn)方法，擁有多臺(tái)生化儀器，不同的試劑、校準(zhǔn)物及試劑盒，為了有效監(jiān)測(cè)重大傳染病的發(fā)生，保證不同實(shí)驗(yàn)室、不同檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果的一致性和可比性，是各中、大型醫(yī)院檢驗(yàn)科追求的目標(biāo)[6]。

本研究從另一角度通過探討影響檢測(cè)結(jié)果的主要因素，為臨床統(tǒng)一檢測(cè)條件及準(zhǔn)確檢測(cè)血清總蛋白提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本次研究結(jié)果表明：不同檢測(cè)儀器運(yùn)用雙縮脲試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)的偏倚，方差齊性(P=0.467)，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.688，P=0.421)；不同檢測(cè)試劑運(yùn)用雙縮脲試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)的偏倚，方差齊性(P=0.574)，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.784，P=0.011)；不同校準(zhǔn)物運(yùn)用雙縮脲試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)的偏倚，方差齊性(P=0.467)，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.289，P=0.000)。不同試劑、儀器和校準(zhǔn)物運(yùn)用雙縮脲試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)的偏倚倚分析表明：(1)蛋白質(zhì)檢測(cè)已廣泛應(yīng)用于肝疾病及流行病學(xué)的研究，目前實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)方法還是比較統(tǒng)一一直的，均采用雙縮脲法。(2)儀器方面，絕大多數(shù)醫(yī)院采用的分析儀如奧林巴斯AU系列、日立HITACHI系列等都經(jīng)過一定的性能評(píng)定，偏倚也應(yīng)當(dāng)不大[7]。本次研究結(jié)果也表明：不同檢測(cè)儀器運(yùn)用雙縮脲試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)的偏倚其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)雙縮脲試劑在檢測(cè)蛋白質(zhì)應(yīng)用中，試劑以及校準(zhǔn)物對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響較大，在檢測(cè)中具有重要的地位，由于各地醫(yī)院發(fā)展情況不一，實(shí)驗(yàn)環(huán)境不同，在臨床中還沒有形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，雙縮脲試劑在檢測(cè)蛋白質(zhì)應(yīng)用中，不同試劑檢測(cè)、不同校準(zhǔn)物對(duì)同一樣本的檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，可以判斷影響雙縮脲法檢測(cè)蛋白質(zhì)檢測(cè)結(jié)果的主要因素為試劑以及校準(zhǔn)物。

我國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性都是非常的重視的，一般實(shí)驗(yàn)室還要參加全國(guó)或全省的室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)，同時(shí)還每天對(duì)室內(nèi)質(zhì)量會(huì)進(jìn)行控制，但由于檢測(cè)條件的不同，運(yùn)用雙縮脲法檢測(cè)蛋白質(zhì)還是會(huì)存在一定的偏差，因此，有必要進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，才能從根本上解決檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性和一致性的問題，而對(duì)于那些正準(zhǔn)備參加實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室來說，這項(xiàng)工作就尤為重要了。完整的比對(duì)實(shí)驗(yàn)它包含比對(duì)以及修正，通過對(duì)比試驗(yàn)可以采取多種方法對(duì)檢測(cè)流程或結(jié)果進(jìn)行校正：比如可以通過不同儀器測(cè)定同一份新鮮血清，對(duì)比檢測(cè)結(jié)果來對(duì)檢測(cè)儀器進(jìn)行校正；也可以通過回歸分析的方式，選取影響因子，利用回歸方程求解找出影響因子來對(duì)其他檢測(cè)條件進(jìn)行校正[8]。還可以用混合血清作為共同校準(zhǔn)品校準(zhǔn)各系統(tǒng)。不同實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自身情況，反復(fù)驗(yàn)證來決定使用何種方法來校正。目前國(guó)內(nèi)相關(guān)研究多參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)的EP9-A[9]文件，對(duì)不同檢測(cè)系統(tǒng)的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行方法比和偏倚評(píng)估，為實(shí)現(xiàn)測(cè)定結(jié)果的溯源性和可比性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。因此，雙縮脲試劑在檢測(cè)蛋白質(zhì)應(yīng)用中，檢測(cè)試劑和校準(zhǔn)物會(huì)對(duì)測(cè)試結(jié)果產(chǎn)生影響，在進(jìn)行試驗(yàn)比對(duì)的時(shí)候，有必要對(duì)檢測(cè)試劑和校準(zhǔn)物造成的檢測(cè)偏差進(jìn)行考慮。

[1] 王時(shí)南, 楊歡. 兩種校準(zhǔn)品和3種雙縮脲試劑測(cè)定血清總蛋白結(jié)果偏倚評(píng)估及方法學(xué)評(píng)價(jià)[J]. 醫(yī)學(xué)研究雜志, 2011(10): 125-128.

[2] 李晶. 血清總蛋白測(cè)定方法及臨床意義[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥應(yīng)用, 2012(9): 28-29.

[3] 張玲, 張玉春. 雙縮脲法測(cè)定血漿總蛋白含量的不確定度評(píng)定[J]. 甘肅醫(yī)藥, 2013(2): 126-128.

[4] National Committee for Clinical Laboratory Standards. Method comparison and bias estimation using patient samples; approved guideline,EP9-A[S]. NCCLS, Pennsylvania, 1995.

[5] Doumas BT. Standards for total serum protein assays a collaborative study[J]. Clin Chem, 1975, 21: 1159-1166.

[6] 閻政禮, 姜曉東, 童金英, 等. 不同檢測(cè)條件下血清總蛋白測(cè)定結(jié)果的偏倚分析[J]. 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué), 2010(1): 27-29.

[7] 盧海景, 張紅鳳, 饒華春. 右旋糖酐對(duì)雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的干擾[J]. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2013(20): 2729-2730.

[8] 陳惠. 1163 名健康人血液總蛋白水平的臨床分析[J]. 求醫(yī)問藥, 2012(4): 51-52.

[9] The National Committee for Clinic. Laboratory Standards. Method comparison and bias estimation using patient samples: approved guideline[M].Second Edition, EP9-A, 2002.

Application Research of Protein Test by Using Biuret Reagent

【W(wǎng)riters】Chen Ningqing1, Zheng Siyu2

1 Zhejiang Medical Device Institute, Hangzhou, 310009

2 School of Materials Science and Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai, 200237

Objective To investigate the biuret reagent to detect proteins in the application, the impact of different test conditions for test results. Methods The biuret method to select three different instruments, reagents, calibrators are arranged in combination to form 27 sets of detection systems, each detection system is a combination of 5 serum samples for testing, 5 measured values obtained, the selection process normality good a serum for the study to determine the mean value of all AST after culling outliers obtained in order to calculate the various detection systems use a combination of biuret reagent to detect proteins bias. Results The use of different detection equipment to detect proteins biuret reagent bias, homogeneity of variance (P=0.467), the difference was not statistically signifcant (F=1.688, P=0.421). different detection reagents using biuret reagent to detect proteins bias, homogeneity of variance (P=0.574), a statistically signifcant difference (F=5.784, P=0.011). different calibrators use biuret reagent to detect proteins bias, homogeneity of variance (P=0.467), the difference was statistically signifcant (F=5.289, P=0.000). Conclusion Biuret reagent in the detection of protein applications, impact detection reagents and calibrators will test result, during the test than when it is necessary to detect deviation detection reagents and calibrators due to be considered.

biuret, total protein, infuential factors

R446.1

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2014.06.020

1671-7104(2014)06-0458-03

2014-09-28

浙江省體外診斷試劑公共服務(wù)平臺(tái)（2011F30008）

陳寧清，E-mail: cnqcool@126.com