短穗魚尾葵果實原花青素粗提物的樹脂純化

張 鏡,劉少娜，黃思梅

(嘉應(yīng)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 梅州 514015)

短穗魚尾葵(Caryotamitis)，又稱叢生魚尾葵、酒椰子，為棕櫚科魚尾葵屬常綠小喬木，高5-8米.喜溫暖，生長適宜溫度為18℃-30℃，較耐寒，對光線適應(yīng)性強，抗旱能力較強，中國南方種植數(shù)量大.目前，短穗魚尾葵主要用于綠化、觀賞及肉質(zhì)莖的加工等[1].短穗魚尾葵果實產(chǎn)量高，且?guī)缀踅K年果實次第成熟.文獻表明短穗魚尾葵果實內(nèi)總酚含量很高[2]，原花青素的含量亦豐富，是開發(fā)天然活性產(chǎn)物難得的資源[3].迄今，國內(nèi)外未見短穗魚尾葵果實原花青素分離純化的研究報道.

大孔吸附樹脂具有穩(wěn)定性高、選擇性強、處理量大、再生方便等優(yōu)點，在天然活性產(chǎn)物工業(yè)化提取分離中廣泛應(yīng)用[4～6].本研究以5種大孔吸附樹脂供試，從中篩選出對短穗魚尾葵果實原花青素吸附量大、解吸率高的樹脂種類，研究其吸附量與解吸率的主要影響因子，獲得短穗魚尾葵果實原花青素大孔吸附樹脂純化的技術(shù)條件，為其原花青素資源開發(fā)奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

采摘果皮顏色褪綠及淡紅色短穗魚尾葵果實，剔除雜質(zhì)和腐爛變質(zhì)的果實，自來水洗凈后晾干果面余水，冷凍干燥，粉碎，80目過篩粉末低溫保存?zhèn)溆?

試驗用乙醇、正丁醇、HCl、NaOH、FeNH4(SO4)2·12H2O等，均為分析純.供試的DS401、AB-8、D101、DA201、DM301，均為天津樹脂廠生產(chǎn).

1.1.2 儀器與設(shè)備

BT2KXL 凍干機(美國Virtis公司)；U-2800 紫外-可見分光光度計(日本日立公司)； PHS-2C 酸度計(上海智光儀器表有限公司)；FA2004 電子分析天平(上海精天電子儀器廠)；JLL28-B 低速大容量多管離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠).

1.2 供試樣品的制備

1.2.1 原花青素粗提物

短穗魚尾葵果實粉末與75%乙醇溶液(pH=2)以1:5的料液比混合，室溫浸提2.5h，4500r/min離心20min，上清液冷凍干燥得棕紅色粉末狀原花青素粗提物.

1.2.2 原花青素的含量測定

以鐵鹽催化法進行原花青素顯色及測定含量[7].取1 mL原花青素粗提物溶液于比色管中，依次加入6 mL正丁醇-鹽酸溶液(95:5，V/V)及0. 2mL 2%硫酸鐵銨溶液，沸水浴40min后迅速冷卻，以蒸餾水代替樣液為參比，測定處理液A546nm值，按公式(1)與(2)計算原花青素的含量(%)及原花青素的質(zhì)量(mg)

(1)

(2)

注：y—原花青素含量/%；x—原花青素質(zhì)量/mg； A 546nm吸光度；V—稀釋倍數(shù)；

W—樣品質(zhì)量(mg)；0. 366—A1%1 cm在546 nm處原花青素的吸光度.

按上述方法測定供試粗提物樣品原花青素的含量為10.446%

1.3 大孔吸附樹脂的篩選

1.3.1 供試樹脂的靜態(tài)吸附

準確稱取樹脂濕基2.0g裝入150mL三角瓶中，加入2.0%原花青素粗提物(原花青素含量為0.209%)樣液50mL，25℃、120r/min振蕩12h，充分吸附后測定溶液吸光值，按公式(3)及(4)計算樹脂吸附量與吸附率.

Qe=(C0-C1)V/W，

(3)

Ee(%)=(C0-C1)/C0×100.

(4)

注：Qe-樹脂吸附量(mg/g)；C0-吸附前溶液中原花青素的質(zhì)量濃度(mg/mL)；C1-吸附后溶液中原花青素的質(zhì)量濃度(mg/mL)；V-溶液體積(mL)；W-樹脂濕重(g)；Ee-吸附率.

1.3.2 吸附原花青素的解吸試驗

取1.0g原花青素吸附飽和樹脂于150mL三角瓶中，各加入70%乙醇溶液50mL，保鮮膜封口，25℃、120r/min振蕩12h，取樣測定溶液的吸光值，按公式(4)及(5)計算樹脂的解吸量與解吸率.

(5)

Ed(%)=Qe/Qd×100.

(6)

注：Qd-樹脂解吸量(mg/g)；C2-解吸液中原花青素的質(zhì)量濃度(mg/mL)；V-溶液體積(mL)；Ed-解吸率.

1.4 樹脂吸附性能的主要影響因素

1.4.1 溫度與吸附量的關(guān)系

準確稱取樹脂濕基2.0g裝入150mL三角瓶中，加入1.0%原花青素粗提物樣液50mL，分別置于溫度設(shè)置為15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃振蕩器，振蕩120r/min，每30min取樣，正丁醇-鹽酸顯色后測定處理液A546nm值.

1.4.2 溫度與吸附平衡時間的關(guān)系

準確稱取樹脂濕基1.0g裝入150mL三角瓶中，加入1.0%原花青素粗提物樣液50mL，分別置于溫度設(shè)置為15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃振蕩器，振蕩120r/min，每30min取樣，正丁醇-鹽酸顯色后測定處理液A546nm值.

輸變電工程時間長，假如沒有提前對其成本實施管理，那么就可能會使得部分居心不良的人鉆了空子，對施工成本進行虛報，大發(fā)不義之財，因此，我們必須改變傳統(tǒng)的成本管理理念，創(chuàng)新管理方式，開源節(jié)流，減少施工成本。遵循成本控制原則，對于施工的每一個階段，都要有專人負責監(jiān)督和記錄，以防出現(xiàn)內(nèi)部虧空，對整個工程進度產(chǎn)生不良影響。要規(guī)范財務(wù)管理流程，財務(wù)部門應(yīng)該實現(xiàn)標準化管理，并不斷對管理與控制體系進行優(yōu)化。

1.4.3 pH與樹脂吸附量的關(guān)系

準確稱取樹脂濕基1.0g裝入150mL三角瓶中，分別加入pH =1、2、3、4、5、6、7、8和9的1.0%原花青素粗提物溶液50mL，置于振蕩器內(nèi)25℃、120r/min振蕩6h，正丁醇-鹽酸顯色后測定處理液A546nm值，計算吸附量.

1.5 樹脂吸附原花青素的解吸

1.5.1 乙醇濃度與解吸效果的關(guān)系

準確稱取1.0g已吸附原花青素的樹脂濕基裝入150mL三角瓶中，分別加入不同體積分數(shù)的乙醇溶液50mL，25℃、120r/min振蕩12h，測定處理液A546nm值.

1.5.2 溫度對解吸性能的影響

準確稱取1.0g已吸附原花青素的樹脂濕基裝入150mL三角瓶中，加入90%乙醇溶液50mL，于設(shè)定溫度下120r/min振蕩12h，取樣正丁醇-鹽酸顯色后測定處理液A546nm值.

1.5.3 pH對解吸性能的影響

準確稱取1.0g已吸附原花青素的樹脂濕基裝入150mL三角瓶中，分別加入不同pH 值的90%乙醇溶液50mL，25℃、120r/min振蕩12h，正丁醇-鹽酸顯色后測定處理液A546nm值.

1.5. 4 解吸正交試驗

分別稱取已吸附原花青素的樹脂濕基1.0g，以解吸溫度、乙醇濃度及溶液的pH值進行3因素、3水平正交試驗，正交試驗設(shè)計如下：

表1 正交試驗設(shè)計

注：A.溫度/℃，B.乙醇濃度/%，C.pH值

1.6 吸附原花青素的動態(tài)解吸試驗

樹脂與10%原花青素粗提物溶液按1:10比例混合，25℃吸附6h后取出,以2倍體積的蒸餾水漂洗60s,準確稱取20g吸附飽和的樹脂裝入2cm×10cm的層析柱，分別以0.50、0.75、1.00、1.25及1.50倍柱床體積流速洗脫，以10mL為1流份收集洗脫液，共收集15流份，洗脫液正丁醇-鹽酸顯色后測定處理液A546nm值.

1.7 處理重復(fù)及數(shù)據(jù)分析

各處理重復(fù)3次，以SPSS 11.0進行數(shù)據(jù)處理，3次重復(fù)數(shù)據(jù)平均值以excel作圖，以Duncans'法進行差異顯著性分析，P<0.0 5 表示差異顯著，P<0.0 1表示差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 供試樹脂的吸附量與解吸率

5種樹脂對短穗魚尾葵果實原花青素均具有一定的吸附能力，其中AB-8與DS401的吸附能力與解吸能力較好，2種樹脂的吸附量45.29、45.42 mg/g，差異不顯著.其次是D101，吸附量42.24mg/g，與上述2樹脂差異顯著.樹脂DA201及DM301的吸附量更低.AB-8與DS401樹脂上的短穗魚尾葵果實原花青素的解吸率高，分別為87.89%及89.91%，兩者無顯著差異.而D101、DA201及DM301樹脂上的原花青素的解吸率均較低(表2).表明弱極性的大孔吸附樹脂AB-8與DS401都較適合短穗魚尾葵果實原花青素的純化，其中DS401樹脂上原花青素的解吸率更高，故以DS401樹脂純化短穗魚尾葵果實原花青更佳.

雖然DS401與AB-8在25℃下對短穗魚尾葵果實原花青素的飽和吸附量相當，但AB-825℃下對山竹殼原花青素的靜態(tài)飽和吸附達76.40mg/g[8]，高于對短穗魚尾葵果實原花青素吸附量，表明短穗魚尾葵果實原花青素與山竹殼原花青素為結(jié)構(gòu)不同的原花青素.

表2 供試樹脂靜態(tài)吸附與解吸效果

2.3 溫度與原花青素吸附量與吸附平衡時間的關(guān)系

2.3.1 溫度對原花青素吸附量

圖1表明在15℃～50℃內(nèi)DS401樹脂對原花青素的吸附量隨溫度的升高而增大，45℃的吸附量為65.637mg/g、50℃的吸附量67.791為mg/g，其吸附分別為25℃吸附量的133.937%及138.332%，兩者差異不顯著.但50℃吸附量較35℃吸附量的差異顯著、較30℃以下的差異極顯著.試驗結(jié)果與張澤生等的研究結(jié)果相近[9]，而DS401對短穗魚尾葵原花青素的吸附量低于AB-8對山楂果中原花青素的吸附量[6].而LS300大孔吸附樹脂樹脂對月柿原花青素的吸附50℃的吸附量幾乎較30℃的吸附量高1倍[10]，兩者差異遠大于本實驗的結(jié)果，表明短穗魚尾葵原花青素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同于上述2類原花青素.

圖1溫度與吸附量的關(guān)系

結(jié)果表明吸附體系的溫度對原花青素在固相與液相的分配影響極大，提高吸附體系的溫度可明顯提高樹脂對原花青素的吸附量，降低吸附后液中原花青素的殘留量，有利于提高穗魚尾葵原花青素的得率.

2.3.2 溫度對原花青素吸附平衡時間的關(guān)系

DS401樹脂1g濕基與1%短穗魚尾葵原花青素粗提取物50mL混合，不同溫度下進行靜態(tài)吸附結(jié)果如圖2所示.由圖2 看出溫度與吸附平衡時間的關(guān)系是在15～30℃內(nèi)，溫度越低吸附平衡時間越長，當溫度升為30℃時吸附平衡時間由15℃的7h縮短為4.5h，但在35～50℃吸附溫度對吸附平衡時間無明顯的影響，吸附平衡時間與30℃無明顯差異.表明吸附體系的溫度30℃以上時，吸附平衡時間為4.5h.

圖2溫度與吸附平衡時間的關(guān)系

2.4 pH對吸附性能的影響

由圖3可知，當原花青素粗提物溶液的pH在1～5時，樹脂對原花青素的吸附量隨pH值增大而提高，pH5時對原花青素的吸附量為56.52mg/g，但當pH值繼續(xù)上升時，吸附量先下降后在pH8時又開始上升，pH9時的吸附率52.04mg/g，且與pH7的吸附量差異顯著(p > 0.05).這與大多數(shù)文獻報道的植物活性物質(zhì)要達到較好的吸附效果一般是在酸性條件下被吸附具明顯差異[11～12].有文獻報道原花青素的穩(wěn)定性受pH影響，在堿性條件下不穩(wěn)定，隨著pH的升高易發(fā)生分解[13]，使吸附后液的吸光值降低，從而造成計算所得的吸附量增加，而DS401樹脂對短穗魚尾葵原花青素的吸附量在pH9時大于pH7的吸附量，顯然不是由于堿性條件下原花青素的分解，而應(yīng)該與原花青素的性質(zhì)有關(guān).

圖3不同pH對吸附效果的影響系

2.5 溫度對原花青素解吸的影響

吸附原花青素的DS401樹脂不同溫度解吸試驗的結(jié)果如圖4所示，在15℃～45℃溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的上升解吸液的吸光值升高，45℃解吸解吸液的吸光度為0.981，50℃解吸解吸液的吸光度值為0.846，較前者低13.761%.45℃解吸解吸液的吸光度較40℃與50℃解吸解吸液的差異均極顯著(p > 0.01).

圖4不同溫度對解析效果的影響系

2.6 pH對解吸的影響

pH7時解吸液靜態(tài)解吸DS401吸附的原花青素，溶液的吸光值1.171，為各處理間的最大吸光度，與其余處理吸光度的差異極顯著，結(jié)果表明中性條件有利于DS401吸附的短穗魚尾葵果實原花青素的解吸，與文獻報道原花青素以洗脫液pH=6.3為適宜洗脫條件的結(jié)果相似[14].

圖5不同pH值對解析效果的影響系

2.7 乙醇濃度對解吸的影響

從圖6看出，乙醇體積分數(shù)在30%～70%范圍內(nèi)，解吸液吸光值變化明顯，各處理的吸光值差異顯著(p > 0.05)，而乙醇體積分數(shù)在70%～90%后吸光值增加不明顯，結(jié)果表明乙醇體積分數(shù)70%解吸原花青素的效果最佳.

圖6不同濃度洗脫液的解析效果

2.8 靜態(tài)解吸正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因子試驗結(jié)果，以解吸溫度、乙醇濃度及解吸液 pH值進行3因素3水平正交試驗.結(jié)果表明極差最大的是解吸液乙醇的濃度，即是不同濃度乙醇解吸效果差異最大，其次是解吸的溫度.試驗結(jié)果顯示，靜態(tài)解析最優(yōu)條件組合為A3B2C2，即在乙醇濃度為80%、溫度45℃及洗脫液pH=8(表3).雖此解吸條件的解吸效果為佳，但若解吸液直接干燥，因除去溶劑后NaOH仍存留于干燥物內(nèi)，干燥物將為強堿性對提取的原花青的穩(wěn)定性極為不利，因而干燥前解吸液的pH應(yīng)先以HCl調(diào)為中性.

表3 原花青素解吸正交試驗結(jié)果

2.9 動態(tài)解吸試驗結(jié)果

吸附原花青素的樹脂裝入層析柱內(nèi)，洗脫液流速與原花青素的解吸效果如圖7所示.洗脫速率越小原花青素的洗脫峰越窄，洗脫效果越好.以0.5倍柱床體積流速洗脫中第7～10流份的流出液中原花青素的共842.61mg，占15流份原花青素總936.30 mg的89.99%，且洗脫峰無明顯拖尾，主峰洗脫總體積約為柱床體積的2倍，至第10流份洗脫液收集結(jié)束的洗脫耗時5h.而0.75BV/h積流速洗脫中第5～9流份的洗脫液原花青素的共879.24mg，占15流份原花青素總936.31mg的93.90%，主峰洗脫總體積為柱床體積的2.5倍，至第9流份洗脫液收集結(jié)束的洗脫耗時4.5h，其原花青素的洗脫峰形亦較好，僅稍有拖尾.而1BV/h、1.25 BV/h及1.5BV/h洗脫的都拖尾明顯.流速0.75BV/h的洗脫峰形雖較0.5BV/h的寬，但解吸的時間較短，且原花青素的回收率較高，因而解吸流速以0.75BV/h較為理想.

圖7不同流速對解析效果的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 短穗魚尾葵原花青素純化靜態(tài)吸附為宜

以乙醇浸提短穗魚尾葵果實原花青素，當除去提取液有機溶劑后具較多的溶性沉淀.若提取液以大孔吸附樹脂動態(tài)吸附分離原花青素，需要在回收溶劑后先離心、或過濾進行固液分離，然后才能將液體上柱.以靜態(tài)吸附法分離原花青素不僅可在溶劑回收后的提取液直接加入樹脂進行吸附，而且更容易控制吸附體系的溫度，提高樹脂原花青素的吸附量.所以，短穗魚尾葵果實原花青素提取液原花青素的分離純化以樹脂靜態(tài)吸附的工藝更適.

3.2 短穗魚尾葵原花青素樹脂純化參數(shù)

研究表明DS401弱極性大孔吸附樹脂對短穗魚尾葵果實原花青素的吸附量最高、解吸效果最佳，是短穗魚尾葵果實原花青樹脂純化的適宜樹脂.DS401樹脂靜態(tài)吸附短穗魚尾葵原花青素在45℃、pH=5下吸附4.5h時的吸附飽和.樹脂吸附的原花青素以80%乙醇、pH=8、溫度45℃、0.75VB/h解吸效果最好，從流出解吸液體積達柱床體積2.5～4.5倍內(nèi)的洗脫液，原花青素的回收率為93.90%.

3.3 短穗魚尾葵原花青素性質(zhì)的特殊性

DS401大孔吸附樹脂在25℃下對短穗魚尾葵原花青素的飽和吸附量，較AB-8相同溫度對山竹殼原花青素的態(tài)飽和吸附量低40.72%[8]；大多數(shù)文獻報道的植物活性物質(zhì)要吸附效果以較低的pH下更好[11、12]，DS401樹脂吸附短穗魚尾葵原花青素在吸附液pH=5時量最大，而且pH=9的吸附量pH=5時吸附量僅低7.93%，而高于pH值為6～8內(nèi)的吸附.原花青素的穩(wěn)定性受pH影響，在堿性條件下不穩(wěn)定，隨著pH的升高易發(fā)生分解[13]，而DS401樹脂對短穗魚尾葵原花青素的吸附量在pH=9時大于pH=7的吸附量.以上結(jié)果表明短穗魚尾葵原花青素可能其性質(zhì)與常見報道的其它原花青的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)有較大的差別.

[1] 金智慧.短穗魚尾葵與魚尾椰子[J].園林,2006(5):43.

[2] LI FU, BO-TAO XU, XING-RONG, et al. Antioxidant Capacities and Total Phenolic Contents of 56 Wild Fruits from South China [J]. Molecules, 2010, 15(12): 8602-8617.

[3] 黃思梅,張鏡,范玉琴,等.短穗魚尾葵果實原花青素的提取工藝[J].食品科學(xué),2012,33(20):04-108.

[4] 陳青, 熊春華,姚彩萍,等.大孔吸附樹脂吸附染料木黃酮的研究[J].食品科技,2011,36(5):199-202.

[5] 董玲燕,李琳,趙雷,等.醬油渣中大豆異黃酮的提取及純化工藝[J].食品科學(xué),2012,33(14):30-35.

[6] 姜紹通,侯晨曄.基于膜分離的茶多酚綠色制備方法研究[J].食品科技,2013,38(5):227-231·

[7] PENG Z, HAYASAKA Y, BAND P G, et al. Quantitative analysis of polymeric procyanidins ( tannins ) from grape ( Vitis vinifera ) seeds by reverse phase high- performance liquid chromatography[J]. J Agric Food Chem, 2001, 49(1): 26- 31.

[8] 楊青,何傳波,魏好程,等.大孔樹脂純化山竹殼原花青素的研究[J].熱帶作物學(xué)報,2013,34(3):569-573.

[9] 張澤生,趙春艷,曹力心,等.大孔吸附樹脂分離純化山楂果中原花青素的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2006,2(16):16-19.

[10] 李仁杰,陳錦屏,張娜,等.超聲波輔助提取月柿原花青素及其純化[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2011,37(3): 225-229.

[11] 張蕊紅,齊永琴,鄧天昇,等.脫脂沙棘籽渣中原花青素的提純與穩(wěn)定性研究[J].食品工業(yè)科技,2011,32(8):310-313.

[12] 馮進,李敏,曾曉雄,等.大孔樹脂純化藍莓葉多酚及其組成分析[J].食品科學(xué),2013, 34(10): 86-91.

[13] 蔣其忠.茶籽殼原花青素的分離純化、穩(wěn)定性及抗氧化活性研究[D].合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[14] 崔瑩,朱清華,楊義聽,等.樹脂法分離純化苦蕎麥殼中原花青素的研究[J].中國糧油學(xué)報,2009,24(4):46-49.