雌激素對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷及心肌細(xì)胞凋亡的影響*

張 洋，武 煜，王紅軍，孟 晶，劉功儉△

(1.徐州醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)院，江蘇徐州 221002；2.江蘇省徐州市第一人民醫(yī)院內(nèi)科 221000)

研究顯示心肌收縮功能降低是各種心血管疾病造成心臟泵血能力降低的主要原因。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，男性和女性的心血管疾病發(fā)病率和嚴(yán)重程度存在明顯差異，且絕經(jīng)前婦女心血管疾病的發(fā)生率明顯低于同年齡男性[1-2]，這表明雌激素對(duì)于維持心血管健康起重要作用[3-4]。然而，這種心肌保護(hù)作用的機(jī)制尚不清楚。

心血管疾病致病因素當(dāng)中，交感腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)活動(dòng)增強(qiáng)在中老年患者當(dāng)中尤為重要，過度增加的兒茶酚胺分泌會(huì)造成急性或慢性心肌損傷，對(duì)于絕經(jīng)后婦女兒茶酚胺的作用更為明顯[5]。有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，細(xì)胞凋亡是心肌損傷的重要原因[6]，損傷后的心肌收縮功能明顯下降。已有研究發(fā)現(xiàn)，凋亡相關(guān)蛋白Bax的高表達(dá)和Bcl-2的低表達(dá)與凋亡的活化有關(guān)[7-8]，而兒茶酚胺過多會(huì)造成心肌細(xì)胞凋亡，心肌損傷，心功能下降[9]。因此，藥物方法抑制心肌細(xì)胞凋亡可能是保護(hù)因兒茶酚胺過多造成心肌損傷的治療靶點(diǎn)[10]。因此，本研究旨在闡明雌激素替代治療對(duì)異丙腎上腺素造成心肌損傷的保護(hù)作用，并證明雌激素保護(hù)心肌的機(jī)制為抑制異丙腎上腺素造成的心肌細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與動(dòng)物分組 正常健康SD 雌性成年大鼠50只，體質(zhì)量200～250 g,由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(使用許可號(hào)：SYXK[su]2002-0038)。實(shí)驗(yàn)主要試劑：異丙腎上腺素購自Sigma公司(美國)，17β 雌二醇購自ABCR公司(德國)，一抗Caspase-3、Bcl-2、Bax、GAPDH與二抗均購自Santa Cruz公司(美國)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由戊巴比妥鈉60 mg/kg麻醉,切除雙側(cè)卵巢。3 d后皮下注射異丙腎上腺素100 mg·kg-1·d-1,連續(xù)5 d[5]。參照本實(shí)驗(yàn)室既往研究[11]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組為假手術(shù)組(Sham組)、雙側(cè)卵巢切除組(OVX組)、心肌損傷組(OVX+ISO+Vehi組)、雌激素4 μg·kg-1·d-1治療組(OVX+ISO+ E2a組)、雌激素40 μg·kg-1·d-1治療組(OVX+ISO+E2b組)。OVX+ISO+Vehiz組和OVX+ISO+E2a組分別皮下注射17β 雌二醇與溶劑連續(xù)4周。

1.2方法

1.2.1大鼠血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定 雌激素替代治療4周后，測(cè)量身長，大鼠戊巴比妥鈉60 mg/kg麻醉后，左側(cè)頸總動(dòng)脈置入微壓力傳感導(dǎo)管，檢測(cè)平均動(dòng)脈血壓(MABP)、左心室舒張末期壓力(LVEDP)、左心室壓力變化速率(±dp/dt)[12]。

1.2.2成年大鼠心肌細(xì)胞分離和培養(yǎng) 分離和培養(yǎng)成年大鼠心肌細(xì)胞的方法如作者之前的研究[13]，簡(jiǎn)而言之，SD大鼠，麻醉后迅速開胸取心臟，稱體質(zhì)量，Langendorff主動(dòng)脈逆行灌流無鈣酶液(含0.04%膠原酶)，循環(huán)灌流20～30 min，將心室組織剪成約1 mm×1 mm×1 mm碎塊，然后用200目尼龍網(wǎng)過濾，室溫下靜置20 min，棄上清，反復(fù)3次，最后將細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中。

1.2.3培養(yǎng)心肌細(xì)胞存活率的計(jì)算 倒置顯微鏡采集橫紋清晰、胞膜完整、長桿狀的心肌細(xì)胞(放大200倍)測(cè)算心肌細(xì)胞桿狀存活率，心肌細(xì)胞肝狀存活率=(桿狀細(xì)胞數(shù)量/全部細(xì)胞數(shù)量)×100%。

1.2.4單個(gè)心肌細(xì)胞收縮功能的測(cè)定 倒置顯微鏡(Nikon E400)視頻記錄心肌細(xì)胞收縮功能的方法如作者之前的研究[13 ]，把培養(yǎng)的心肌細(xì)胞置于收縮功能分析裝置的細(xì)胞浴槽內(nèi),2 mmol/L鈣和10-7mmol/L 異丙腎上腺素的KH液灌流，0.5 Hz電刺激。采集橫紋清晰、胞膜完整、長桿狀的心肌細(xì)胞(放大200倍)分析其收縮的狀況，以及收縮時(shí)間(TTP)、舒張90%時(shí)間(R90)，心肌細(xì)胞收縮幅度(%)=(心肌細(xì)胞舒張末長度-收縮末長度)/心肌細(xì)胞靜息長度×100%。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 Annexin V-PI雙染色法標(biāo)記分離培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。每樣本細(xì)胞數(shù)控制為(1～5)×106/mL，500～1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。加入熒光(SA-FLOUS)溶液4 ℃下孵育20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞；右上象限是非活細(xì)胞，即壞死及凋亡細(xì)胞。

1.2.6Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 凋亡相關(guān)蛋白Caspase 3、Bcl-2和Bax蛋白通過Western blot方法檢測(cè)。等量蛋白樣品(20 μg)加入10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳 (SDS-PAGE)分離，轉(zhuǎn)膜后加入一抗(1∶1 000)4 ℃過夜，二抗(1∶3 000)室溫孵育2 h。Image J3.0軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1外源性雌激素替代治療對(duì)大鼠一般指標(biāo)的影響 為了檢測(cè)雌激素在心泵功能中的作用，將雌性大鼠雙側(cè)卵巢切除，該模型可以明顯降低血中雌激素水平，隨后注射異丙腎上腺素，子宮切除后的雌性大鼠，血漿中雌激素水平(圖1A)、子宮體質(zhì)量(圖 1B)顯著降低，但是大鼠身長沒有改變(本文沒有顯示該數(shù)據(jù))。與Sham組和OVX組比較，OVX+ISO+Vehi組心臟質(zhì)量與心臟質(zhì)量/身長比率增加(圖 1C、D)。而OVX+ISO+E2b組較OVX+ISO+Vehi組血漿雌激素水平與子宮質(zhì)量顯著增加(圖 1A、B)，并且降低了由于ISO刺激而引起的心臟質(zhì)量與心臟質(zhì)量/身長比率(圖 1C、D)。但是較低劑量的雌激素(4 μg·kg-1·d-1)對(duì)血漿雌激素水平升高不明顯(圖 1A)，而且對(duì)恢復(fù)子宮質(zhì)量的作用非常有限(圖 1B)。在實(shí)驗(yàn)中，還發(fā)現(xiàn)較低劑量的雌激素(4 μg·kg-1·d-1)對(duì)于異丙腎上腺素所導(dǎo)致的心臟質(zhì)量和心臟質(zhì)量/身長比率的增加幾乎沒有作用(圖 1C、D)。

A：血漿雌激素水平；B：子宮質(zhì)量；C：心臟質(zhì)量；D：心臟質(zhì)量/身長。*：P<0.05，與Sham組比較；#：P<0.05，與OVX+ISO+Vehi組比較。

A：MABP水平；B：LVEDP水平；C：±dp/dt水平；D：-dp/dt水平。*：P<0.05,與sham組比較；#：P<0.05,與OVX+ISO+Vehi組比較。

2.2外源性雌激素替代治療改善異丙腎上腺素造成的心肌收縮功能降低 經(jīng)大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈置管，并逆行進(jìn)入左心室記錄各組大鼠的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。與Sham組和OVX組比較，OVX+ISO+Vehi組平均動(dòng)脈血壓(MABP)與左室舒張末壓(LVEDP)明顯升高(圖 2A、B)，但是±dp/dt顯著降低(圖2C、D)。而OVX+ISO+E2b組較OVX+ISO+Vehi組MABP與LVEDP明顯降低(圖 2A、B)，±dp/dt升高(圖2C、D)。但是OVX+ISO+Vehi組對(duì)于ISO所導(dǎo)致的MABP、LVEDP升高，±dp/dt降低幾乎無作用(圖 2A～D)。

2.3外源性雌激素替代治療對(duì)單個(gè)心肌細(xì)胞的影響 通過倒置顯微鏡觀察記錄各組分離培養(yǎng)的單個(gè)成年大鼠心肌細(xì)胞，在體外經(jīng)電刺激收縮搏動(dòng)的影像。Sham組與OVX組單個(gè)心肌細(xì)胞橫紋清晰、包膜完整，細(xì)胞長度與直徑正常，而OVX+ISO+Vehi組心肌細(xì)胞明顯肥大，不規(guī)則，細(xì)胞長度與直徑明顯增加，而OVX+ISO+E2b組心肌細(xì)胞形態(tài)明顯改善，但OVX+ISO+E2a組心肌細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)的極為有限。見圖3。

A：Sham組;B:OVX組;C:OVX+ISO+Vehi組;D:OVX+ISO+E2a組;E:OVX+ISO+E2b組。A、B、E放大倍數(shù)為400倍；C、D放大倍數(shù)為200倍。

圖3各組大鼠單個(gè)心肌細(xì)胞光學(xué)顯微鏡觀察

A：心肌細(xì)胞桿狀率；B：收縮幅度；C：TTP；D：R90。*：P<0.05，與sham組間比較；#：P<0.05,與OVX+ISO+Vehi組間比較。

同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，與Sham組或OVX組相比，OVX+ISO+Vehi組心肌細(xì)胞桿狀率、收縮幅度明顯降低(圖 4A、B)，TTP及R90明顯延長(圖 4C、D)。而OVX+ISO+E2b組相對(duì)于OVX+ISO+Vehi組心肌細(xì)胞的桿狀率、收縮幅度顯著增加(圖 4A、B)，而TTP與R90則明顯下降(圖 4C、D)。但是OVX+ISO+E2a組心肌細(xì)胞的這種恢復(fù)作用幾乎沒有(圖 4A～D)。

2.4外源性雌激素替代治療對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響 分離培養(yǎng)的心肌細(xì)胞經(jīng)Annexin V-PI雙染色法標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率(圖 5A～E)，與Sham組或OVX組相比，OVX+ISO+Vehi組心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加(圖 5F)，而OVX+ISO+E2b組相對(duì)于OVX+ISO+Vehi組心肌細(xì)胞凋亡率顯著下降，但是OVX+ISO+E2a組心肌細(xì)胞凋亡率下降沒有OVX+ISO+E2b組明顯，且與OVX+ISO+Vehi組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖 5F)。

A～E：雙染色標(biāo)記法；F：流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。*:P<0.05,與sham組間比較；#:P<0.05,與OVX+ISO+Vehi組間比較。

A：Caspase 3表達(dá)；B：Bax表達(dá)；C:Bcl-2表達(dá)。*：P<0.05，與sham組間比較；#：P<0.05，與OVX+ISO+Vehi組間比較。

2.5外源性雌激素替代治療對(duì)心肌細(xì)胞Caspase 3、Bcl-2、Bax表達(dá)的影響 利用Western blot分析心肌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Caspase 3、Bcl-2、Bax的表達(dá)情況。與Sham組或OVX組相比，OVX+ISO+Vehi組心肌細(xì)胞Caspase 3、Bax表達(dá)顯著增加(圖 6A、B)，而Bcl-2表達(dá)降低(圖 6C)。與OVX+ISO+Vehi組比較，OVX+ISO+E2b組心肌細(xì)胞Caspase 3、Bax表達(dá)明顯降低(圖 6A、B)，而Bcl-2表達(dá)增高(圖 6C)。但是OVX+ISO+E2a組心肌細(xì)胞Caspase 3、Bcl-2、Bax的表達(dá)與OVX+ISO+Vehi組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖 6A～C)。

3 討 論

絕經(jīng)前女性心血管疾病的發(fā)病率較低，但更年期后這種優(yōu)勢(shì)明顯降低，這表明雌性激素，尤其是雌激素在減少心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)中起到舉足輕重的作用[14]。而且，隨著絕經(jīng)后女性年齡的增長，其心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)也逐步增加，這與逐漸減少的血漿雌激素水平直接相關(guān)。而無論女性還是男性，雌激素均可改善血管舒張反應(yīng)，降低缺血造成的心肌損傷[15]。所以，雌激素也許對(duì)心肌具有直接的保護(hù)作用。

在心肌損傷大鼠的離體心臟中，沒有太多的證據(jù)可以表明心肌收縮功能的改變與細(xì)胞凋亡間的關(guān)系。而目前的研究表明，雌激素環(huán)境對(duì)心臟非常重要，在異丙腎上腺素刺激造成心肌損傷之后進(jìn)行雌激素替代治療，通過測(cè)量在體心臟MABP、LVEDP和±dp/dt，發(fā)現(xiàn)心臟收縮功能明顯改善。而且通過維持卵巢切除后雌性大鼠的血漿雌激素水平，可以增加單個(gè)心室肌細(xì)胞收縮功能，減少心肌細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)。同時(shí)驗(yàn)證了雌性大鼠卵巢切除動(dòng)物模型血漿雌激素水平和子宮質(zhì)量降低，是可以通過雌激素連續(xù)替代治療得以恢復(fù)的。通過視頻記錄了分離培養(yǎng)的成年大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞受電刺激而收縮的動(dòng)態(tài)圖像，從中截取了照片觀察心肌細(xì)胞形態(tài)改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異丙腎上腺素連續(xù)大劑量刺激可引起心肌細(xì)胞肥大，長度與直徑均有不同程度的增加，而收縮幅度與速率則明顯降低。通過連續(xù)皮下注射雌激素后，心肌細(xì)胞的形態(tài)與功能均有不同程度的改善，尤以高劑量雌激素(40 μg·kg-1·d-1)替代治療改善顯著，而低劑量雌激素(4 μg·kg-1·d-1)的恢復(fù)效果不甚明顯。這表明雌激素在40 μg·kg-1·d-1劑量可以明顯改善異丙腎上腺素引起的心肌受損。

此外，本研究利用Annexin V-PI雙染法標(biāo)記分離培養(yǎng)的成年大鼠心肌細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)，大劑量異丙腎上腺素連續(xù)刺激明顯增加心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量，但經(jīng)雌激素40 μg·kg-1·d-1替代治療4周后凋亡數(shù)量明顯減少，而4 μg·kg-1·d-1作用不明顯。心肌細(xì)胞凋亡是心肌損傷的主要原因之一[16]。有研究表明，Bcl-2家族蛋白在調(diào)節(jié)生理和病理性細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這些蛋白質(zhì)包括促進(jìn)細(xì)胞死亡的Bax、Bad和抑制細(xì)胞死亡的Bcl-2、Bcl-x等[17]。誘導(dǎo)和抑制細(xì)胞凋亡的蛋白相互作用，形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而細(xì)胞的存活或者死亡的調(diào)控基于這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中促凋亡和抗凋亡蛋白的比率[18]。已經(jīng)明確的是Bax/Bcl-2蛋白比率增高可以明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19]。本研究證實(shí)經(jīng)雌激素40 μg·kg-1·d-1劑量持續(xù)4周的替代治療可以上調(diào)Bcl-2，同時(shí)下調(diào)Bax的表達(dá)，而4 μg·kg-1·d-1的治療劑量并沒有明顯作用。這些結(jié)果顯示，雌激素替代治療可以防治兒茶酚胺類激素過多而引起的心肌細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)受損的心肌細(xì)胞。因此，作者認(rèn)為補(bǔ)充雌激素可能是通過上調(diào)抗凋亡蛋白，下調(diào)促凋亡蛋白的表達(dá)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用的。雌激素替代治療調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的機(jī)制尚不清楚，雌激素調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的機(jī)制亦不明確。但是雌激素替代治療會(huì)引起許多抗氧化劑影響細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)，所以，雌激素的抗氧化與抗脂質(zhì)過氧化的作用可能是其主要機(jī)制[20]。

綜上所述，雌激素替代治療，尤其是40 μg·kg-1·d-1劑量，可以明顯改善由于異丙腎上腺素刺激增加心肌細(xì)胞凋亡而造成的心肌損傷、心肌收縮功能下降。而且此濃度的雌激素替代治療可能對(duì)卵巢功能不足而引起的心肌收縮功能降低起到保護(hù)作用。本研究還表明，增加Bcl-2蛋白、減少Bax蛋白的表達(dá)在雌激素心臟保護(hù)作用中起到了至關(guān)重要的作用。所以，適宜劑量的雌激素替代治療對(duì)于兒茶酚胺類激素異丙腎上腺素增加造成的心肌細(xì)胞凋亡、心肌收縮功能降低具有明顯的保護(hù)作用。

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