雷公藤藥材中雷公藤甲素及總二萜內(nèi)酯的含量測定※

馬鑫斌 巴文強 王 玎 王利勝*

（1廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣州510006；2華南農(nóng)業(yè)大學醫(yī)院，廣州510642）

雷公藤藥材中雷公藤甲素及總二萜內(nèi)酯的含量測定※

馬鑫斌1，2巴文強1王 玎1王利勝1*

（1廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣州510006；2華南農(nóng)業(yè)大學醫(yī)院，廣州510642）

目的建立雷公藤藥材中雷公藤甲素及總二萜內(nèi)酯含量測定的方法。方法采用高效液相色譜法，色譜柱：Platisil ODS柱（250mm×4.6mm，5μm），以甲醇-水（45∶55）為流動相進行洗脫，于218nm波長處檢測，測定雷公藤甲素的含量；采用Kedde顯色法，在550nm波長處測定吸光度，測定總二萜內(nèi)酯的含量。結(jié)果以高效液相色譜法測定雷公藤甲素，在0.58～46.40μg·mL-1（r＝0.9999）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為100.52%（n＝6）；比色法測定雷公藤總二萜內(nèi)酯（以雷公藤甲素計）在0.49-39.36μg·mL-1（r＝0.9999）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為93.28%（n＝6）；雷公藤藥材中雷公藤甲素平均含量為4.20μg· g-1，總二萜內(nèi)酯為86.64μg·g-1。結(jié)論本實驗所建立的方法穩(wěn)定，精密度良好，適合于雷公藤甲素及總二萜內(nèi)酯的含量測定，可用于雷公藤藥材的質(zhì)量控制。

雷公藤甲素；總二萜內(nèi)酯；高效液相色譜法；顯色法

雷公藤為衛(wèi)茅科植物雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook．F．）的根，又名黃藤木、斷腸草、紅藥等，具有抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用［1-2］。自20世紀60年代應用于治療類風濕關(guān)節(jié)炎（RA），雷公藤以其見效快、療效確切而被推薦為治療RA的首選藥物。雷公藤主要含有雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤堿、雷公藤次堿等，此外還含三萜類、倍半萜類及衛(wèi)矛醇、衛(wèi)矛堿等，其中二萜類和生物堿類是主要活性成分［3-4］，而且一種成分往往具有多方面，不同成分又具有相近的藥理活性，這些活性成分同時也是毒性成分［5-6］。目前，大多數(shù)對于雷公藤藥材的質(zhì)量評價主要是對雷公藤甲素進行含量測定，然而單一的化學成分不能完全反映出藥材的質(zhì)量，因此本研究再增加總二萜內(nèi)酯大類成分進行質(zhì)量控制。本文分別以HPLC和比色法對雷公藤甲素和總二萜內(nèi)酯進行含量測定，從單個有效成分和有效成分總類對雷公藤藥材質(zhì)量進行分析，所建立的方法穩(wěn)定可靠，可為雷公藤藥材質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。

1 實驗材料

1.1實驗儀器KQ5200DE型數(shù)控超聲清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司），AUW120電子分析天平（日本島津），ELB200電子天平（日本島津），SKM型數(shù)顯恒溫電熱套（山東鄄城光明儀器有限公司），Waters高效液相色譜儀（2487紫外檢測器，515泵，美國Waters公司），N3000色譜工作站（浙江大學），UV-2450型紫外可見分光光度計。

1.2藥品與試劑雷公藤甲素對照品（批號：111567-200502，購于中國藥品生物制品檢定所），甲醇為色譜純，水為純水，中性氧化鋁（100-200目，上海五四化學試劑有限公司），3，5-二硝基苯甲酸（阿拉丁，批號：39575），其余試劑均為分析純。

雷公藤藥材購于安國市冷背藥材有限公司（產(chǎn)自河南），經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學李薇教授鑒定為衛(wèi)矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.F.的根。

2 方法與結(jié)果

2.1高效液相色譜法測定雷公藤甲素的含量

2.1.1對照品貯備液的配制精密稱取干燥至恒重的雷公藤甲素對照品適量，置25mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度即得濃度為0.058mg·mL-1的對照品貯備液。

2.1.2供試品溶液的制備取雷公藤藥材粉末5g（過3號篩），精密稱定，加入95%乙醇溶液100mL回流提取3次（3，2，2h），過濾，合并濾液，水浴揮干乙醇至適量。稱取中性氧化鋁8g，濕法裝柱（內(nèi)徑1.0cm），樣品上柱，用30mL乙酸乙酯洗脫，洗脫液濃縮至干，殘留物用適量無水乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中，無水乙醇定容至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.1.4色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗色譜柱：Platisil ODS柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相：甲醇-水（45∶55），檢測波長：218nm，柱溫：室溫，流速：1.0mL ·min-1，進樣量：20μL。在上述色譜條件下，雷公藤甲素與相鄰峰的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)以雷公藤甲素計大于3000。雷公藤甲素對照品，樣品及空白對照色譜圖，見圖1。

圖1 雷公藤甲素的HPLC色譜圖

2.1.5線性關(guān)系考察精密吸取雷公藤甲素對照品貯備液0.05、0.25、0.5、0.75、1、2、4mL置5mL容量瓶中，無水乙醇定容至刻度，配制成不同濃度的對照品溶液。用“2.1.4”項下色譜條件進行分析。以雷公藤甲素對照品溶液濃度X（μg·mL-1）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線。得到線性回歸方程Y＝45186.8X-11192.8，r＝0.9999（n＝7），表明雷公藤甲素在0.58-46.40μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.6精密度試驗精密吸取對照品溶液20μL，連續(xù)進樣6次，測定，計算得峰面積RSD為1.10%，表明儀器的精密度良好。

2.1.7穩(wěn)定性試驗精密吸取同一份供試品溶液20μL，分別于制備好后1、2、4、6、8、12h進樣一次，測定，結(jié)果表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定，其峰面積RSD為0.80%。

2.1.8重現(xiàn)性試驗取同一批雷公藤藥材粉末5g，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備成6份供試品溶液，取各供試品溶液20μL，按“2.1.4”項下色譜條件進行測定，得其峰面積RSD為1.91%，表明重現(xiàn)性良好。

2.1.9加樣回收試驗精密稱取已知含量的雷公藤粉末2.5g，共6份，精密加入一定量的雷公藤甲素對照品貯備液，揮干。照“2.1.2”項下制備供試品溶液，按“2.1.4”項下色譜條件進行測定雷公藤甲素峰面積，計算平均回收率為100.52%，RSD為2.28%（n＝6）。

2.1.10樣品測定稱取同一批雷公藤粉末5g，共3份，精密稱定，照“2.1.2”項下制備樣品溶液，各精密吸取20μL進樣測定雷公藤甲素的含量，結(jié)果見表1。

在平時積極學習應急預案，落實各項預防及搶救準備工作；定期請從事急性中毒研究方面的專家，為相關(guān)醫(yī)護人員講課，使其不斷提高有關(guān)中毒藥品、危害性、處理方法的理論水平；另外，亦應制定突發(fā)性職業(yè)中毒危機處理方案，并開展學習，掌握危機處理方案中的具體方法，確保能夠在急救護理工作中熟練運用；最后，平時應做好搶救演練工作，提高應急能力，有利于促進搶救效率的提高[3] 。

表1 含量測定結(jié)果

2.2紫外可見分光光度法測定雷公藤總二萜內(nèi)酯的含量［7-10］。

2.2.1對照品貯備液的制備精密稱取雷公藤對照品0.00123g，置25mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2顯色劑的配制2%3，5-二硝基苯甲酸溶液：稱取3，5-二硝基苯甲酸2g，加無水乙醇溶解成100mL即得。2%氫氧化鉀溶液：稱取氫氧化鉀2g，加純水溶解成100mL即得，臨用前1：1混合。

2.2.3供試品溶液的制備精密吸取“2.1.2”項下供試品溶液1mL，置5mL容量瓶中，無水乙醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.4檢測波長的選擇精密吸取雷公藤甲素對照品貯備液和供試品溶液各2mL，置10mL試管中，在冰水浴中精密加入2mL的2%3，5-二硝基苯甲酸溶液和2mL的2%氫氧化鉀溶液，搖勻，冰水浴中放置10min，取出，用自來水沖洗管壁2min，搖勻，以2mL的無水乙醇加2mL的2%3，5-二硝基苯甲酸溶液和2mL的2%氫氧化鉀溶液為參比，在400～800nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果表明對照品貯備液和供試品溶液的最大吸收峰在550nm波長處，故選550nm為測定波長。

2.2.5線性關(guān)系考察精密吸取雷公藤甲素對照品貯備液0.05、0.25、0.5、0.75、1、2、4mL置5mL容量瓶中，無水乙醇定容至刻度，配制成不同濃度的對照品溶液。各精密吸取2mL在550nm處測定吸光度，操作方法同“2.2.4”項下，以吸光度A為縱坐標，濃度C（μg· mL-1）為橫坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程為A＝0.0122C＋0.0002，r＝0.9999（n＝7），表明雷公藤總二萜內(nèi)酯（以雷公藤甲素計）在0.49～39.36μg·m L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6精密度試驗精密吸取雷公藤甲素對照品溶液2mL，按“2.2.4”項下操作，連續(xù)重復測定6次，計算其RSD值為0.20%，表明儀器的精密度良好。

2.2.7穩(wěn)定性試驗精密吸取供試品溶液2mL，按“2.2.4”項下操作，于制備好后1h內(nèi)測定吸光度（每隔5min），考察1h內(nèi)供試品溶液顯色穩(wěn)定性，結(jié)果表明0～20min內(nèi)吸光度穩(wěn)定（RSD＝2.48%，n＝5）。

2.2.8重現(xiàn)性試驗取“2.1.8”項下供試品溶液按“2.2.3”項下制備供試品溶液，按“2.2.4”項下操作，測定其吸光度，計算得其RSD值為1.82%（n＝6）。

2.2.9加樣回收試驗取已知含量的雷公藤藥材粉末2.5g，共6份，精密稱定，各樣品中加入與供試品等量的雷公藤甲素對照品貯備液，揮干，按“2.1.2”項下制備供試品溶液，按“2.2.4”項下操作，測定其吸光度，代入標準曲線，計算平均加樣回收率為93.28%，RSD為1.72%（n＝6）。

2.2.10樣品含量測定取“2.1.10”項下各樣品溶液，按“2.2.3”項下制備樣品溶液，照“2.2.4”項下操作，測定其吸光度，代入標準曲線計算雷公藤總二萜內(nèi)酯的含量，結(jié)果見表1。

3 討論

3.1提取條件的考察本研究對超聲和回流兩種提取條件進行了考察，結(jié)果經(jīng)過超聲處理測得雷公藤甲素平均含量為1.49μg·g-1（RSD＝1.97%，n＝3），總二萜內(nèi)酯為38.75μg·g-1（RSD＝1.54%，n＝3），而進行回流處理測得的雷公藤甲素平均含量為1.92μg·g-1（RSD＝2.87%，n＝3），總二萜內(nèi)酯為42.51μg·g-1（RSD＝2.32%，n＝3），因此本實驗選擇回流作為提取條件。

3.2提取溶劑的選擇本研究考察了甲醇、乙醇、乙酸乙酯的回流提取，結(jié)果乙醇的提取效率較高，較完全，故選擇乙醇作為本實驗的提取溶劑。經(jīng)過甲醇提取測得的雷公藤甲素平均含量為1.32μg·g-1（RSD＝2.04%，n＝3），總二萜內(nèi)酯為40.49μg·g-1（RSD＝1.13%，n＝3），經(jīng)過乙醇提取測得的雷公藤甲素平均含量為2.43μg ·g-1（RSD＝2.58%，n＝3），總二萜內(nèi)酯為46.43μg· g-1（RSD＝1.13%，n＝3），經(jīng)過乙酸乙酯提取測得的雷公藤甲素平均含量為1.70μg·g-1（RSD＝1.93%，n＝3），總二萜內(nèi)酯為37.56μg·g-1（RSD＝2.66%，n＝3）。

3.3中性氧化鋁與洗脫液用量的考察使用中性氧化鋁可吸附色素及極性物質(zhì)，本實驗對中性氧化鋁用量進行了考察，發(fā)現(xiàn)8g的用量能夠較好地分離和洗脫雷公藤甲素出來，極大地消除了色素的干擾。本研究選擇乙酸乙酯作為洗脫液［11-12］，洗脫液用量考察發(fā)現(xiàn)，洗脫液的用量對雷公藤甲素和總二萜內(nèi)酯的含量并沒有太大的影響，故選擇洗脫液體積30mL進行洗脫。

3.4流動相的考察流動相為甲醇-水體系，比例為40∶60時，保留時間大約為23min，但有雜質(zhì)峰的影響，出現(xiàn)重疊峰，反復調(diào)整流動相比例，當比例為45∶55時能夠較好的分離，峰形較好。

雷公藤藥材中有效成分較多，其中雷公藤甲素和總二萜內(nèi)酯是主要的有效成分，是雷公藤藥材質(zhì)量控制的重要檢測指標，本研究分別建立的兩種檢測方法簡單可行，能夠制備一份供試品同時檢測出二者含量。雷公藤藥材的作用主要是通過多組分的協(xié)調(diào)作用而起療效的，僅靠單一含量測定指標對質(zhì)控作用的局限性較大，應選擇多個質(zhì)控指標并建立含量測定方法，構(gòu)建多指標含量測定體系，以期進一步提高藥材質(zhì)量標準水平和質(zhì)量控制的水平，保證雷公藤藥材用藥的安全與有效。

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菊花為枕 明目安神

菊花枕在醫(yī)籍中早有記載，《本草綱目》即有菊花＂作枕明目＂之說。單就菊花枕而言，又有黃菊花和白菊花之分。黃菊花枕可防風熱外感，白菊花枕可養(yǎng)肝明目。菊花與綠豆皮、黑豆皮為伍，前者清熱之功更增；后者則以清肝明目見長，是防治肝陽上亢之頭昏目眩及諸目疾之良方。

菊花通竅枕黃菊花300g，白芷、辛夷各150g，裝入枕芯。黃菊花清熱疏風。王安石《字說》云：“芷香可養(yǎng)鼻，又可養(yǎng)體”；《本草綱目》說：“白芷療風通用，其氣芳香，能通九竅?！毙烈囊嗫山獗硎栾L通鼻竅。故此枕可治鼻塞不通、不聞香臭、流涕腥臭、頭痛、眉棱骨痛之鼻淵證，對頭風眩暈、風火牙痛，亦有良效。

菊花明目枕黃白菊花各150g，配苦蕎麥皮200g，黑豆皮100g，決明子300g，同裝入枕芯中。此枕養(yǎng)陰清熱，對肝陰不足、肝火上炎而致的目赤腫痛、干澀羞明、視物不清等癥，均有良好療效。

——中國中醫(yī)藥報

Dedtermination the Content of Triptolide and Total Diterpene Lactones in Tripterygium Wilfordii Hook.F．

Ma Xinbin1,2Ba Wenqiang1Wang D ing1Wang Lisheng1?
（1 School of Chinese Herbal Medicine,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006,China；2 Hospital of South China Agriculture University,Guangzhou 510642,China）

ObjectiveTo develop methods for the determination of total diterpene lactones and triptolide in Tripterygium wilfordii Hook.F.MethodsThe HPLC analysis for triptolide was carried on an Platisil ODS column（250mm×4.6mm，5μm），to the methanol：water（45：55）as mobile phase elution and UV detection at 218nm，determine the content of triptolide．A colorimetric method was established for the assay of the total diterpene lactones with 3，5-dinitrobenzoic acid as the coloring reagent and measuring of the absorbance at 550nm．ResultsThe calibration curves were linear in the ranges from 0.58～46.40μg·mL－1（r＝0.9999）for triptolide with HPLC and from 0.49～39.36μg·mL－1（r＝0.9999）for the total diterpene lactones（caculated as triptolide）with colorimetric method．The average recoveries（n＝6）were 100.52%and 93.28%，respectively．The average content of triptolide in Tripterygium wilfordii Hook．F．is 4.20μg·g－1，total diterpene lactones is 86.64μg·g-1．ConclusionThe method is in good reproducibility，precision and stability and is fit to determine the total diterpene lactones and triptolide in Tripterygium wilfordii Hook．F．At the same time，they can be used for the assay and quality control of the Tripterygium wilfordii Hook．F．

Triptolide；Total diterpene lactones；HPLC；Colorimetric method

10.3969／j.issn.1672-2779.2014.06.097

：1672-2779（2014）-06-0153-03

蘇 玲 本文校對：劉 冰

2013-12-28）

教育部產(chǎn)學研結(jié)合項目［No：2012B091100486］

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