不同濃度乙醇對(duì)活體家兔腹腔神經(jīng)叢毀損的組織學(xué)觀察

目的以不同濃度乙醇對(duì)活體家兔進(jìn)行腹腔神經(jīng)叢阻滯毀損，并進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法成年新西蘭大白兔48只，按隨機(jī)化原則分為手術(shù)對(duì)照組、50%乙醇組、75%乙醇組和100%乙醇組，各12只。手術(shù)對(duì)照組給予生理鹽水，乙醇各濃度組任選6只共18只在給藥1周后活檢，其余18只在給藥3個(gè)月后活檢。摘取實(shí)驗(yàn)側(cè)腹腔神經(jīng)節(jié)和腹腔神經(jīng)叢標(biāo)本，采用Thionine硫堇染色法顯示尼氏體，HPIAS-1000病理圖文報(bào)告系統(tǒng)對(duì)尼氏體定量檢測(cè)平均光密度值。結(jié)果1周后，對(duì)照組神經(jīng)節(jié)中細(xì)胞清晰可見，核大而圓。50%乙醇組，少量神經(jīng)元核仁消失，少量髓鞘消失。75%乙醇組和100%乙醇組大部分神經(jīng)元核仁消失，而胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體變細(xì)，髓鞘大部分消失。3個(gè)月后，不同濃度乙醇組神經(jīng)節(jié)鏡下觀結(jié)果與1周相似。圖像分析顯示，與手術(shù)對(duì)照組比較，乙醇組尼氏體染色平均光密度明顯降低（P＜0.01）；與50%乙醇組比較，75%乙醇組、100%乙醇組1周和3個(gè)月尼氏體平均光密度值均明顯下降（P＜0.05）；75%乙醇組與100%乙醇組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各濃度乙醇組1周與3個(gè)月比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論50%、75%和100%乙醇對(duì)兔腹腔神經(jīng)叢均有不同程度的變性作用，75%乙醇是更為適宜的濃度。

家兔；乙醇；腹腔神經(jīng)叢；毀損；組織學(xué)觀察

經(jīng)皮腹腔神經(jīng)叢乙醇阻滯（neurolytie celiacplexus block with alcohol，NCPBA）對(duì)減輕或消除上腹部疼痛的有效性已被很多國(guó)內(nèi)、外學(xué)者所證實(shí)，近期療效顯著，但中遠(yuǎn)期療效卻不盡相同，對(duì)阻滯所用的乙醇濃度也有不同的看法[1-2]。本研究將活體家兔以不同濃度乙醇進(jìn)行腹腔神經(jīng)叢阻滯毀損，并進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng) 物 6月齡健康成年雄性新西蘭大白兔48只，體質(zhì)量2.0～2.5kg，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SXCK（浙）2009-0042。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品 無水乙醇由沈陽(yáng)試劑一廠提供，75%乙醇和50%乙醇在每次使用前由無水乙醇加無菌蒸餾水后，用乙醇計(jì)精確測(cè)定其濃度。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1分 組 隨機(jī)分為手術(shù)對(duì)照組、50%乙醇組、75%乙醇組和100%乙醇組，各12只，其中乙醇治療后各組任選6只共18只在注藥后1周活檢，另各組共18只在注藥后3個(gè)月活檢。

2.2造 模 氯胺酮靜脈麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，腹部脫毛、消毒，沿腹部行正中切口，逐層暴露直至腹膜后，找到腹腔神經(jīng)叢（腹主動(dòng)脈腹腔干分叉處），固定硬膜外導(dǎo)管開口于腹腔神經(jīng)叢中心，用小兒連續(xù)硬膜外穿刺針明視下經(jīng)背部將硬膜外導(dǎo)管引出，逐層縫合腹壁。手術(shù)完畢，兔清醒后籠養(yǎng)，青霉素40萬U，1次/12h，肌肉注射。待傷口Ⅰ期愈合后，視造模成功，各乙醇組按1.8mL/kg注入乙醇（注入乙醇根據(jù)人體腹腔神經(jīng)叢酒精毀損劑量一般為0.5～0.6mL/kg，人和兔等效劑量換算系數(shù)1:3，活體兔腹腔神經(jīng)叢酒精毀損劑量定為1.8mL/kg），注藥后1周和3個(gè)月。按上述程序剖腹，取出實(shí)驗(yàn)側(cè)腹腔神經(jīng)節(jié)和腹腔神經(jīng)叢標(biāo)本。對(duì)照組接受生理鹽水，按同樣方法取出標(biāo)本。

2.3標(biāo)本制備 常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋及切片（厚約8～10μm）。

2.4尼氏小體顯示 采用Thionine硫堇染色法。每組切片10張，按下列程序進(jìn)行染色：蒸餾水洗、用2%硫堇水溶液置于50～60℃溫箱內(nèi)浸染30～60min、蒸餾水稍洗、用95%乙醇液迅速分化、無水乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果顯示尼氏小體呈深藍(lán)色塊狀或顆粒狀，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色。

2.5圖像分析 采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告系統(tǒng)對(duì)尼氏體染色結(jié)果進(jìn)行定量檢測(cè)，放大400倍，檢測(cè)正常手術(shù)對(duì)照組、不同濃度乙醇組在單位視野中尼氏小體染色的平均光密度，每例標(biāo)本取3張切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)倍鏡視野（× 400），測(cè)定每個(gè)視野下尼氏體染色平均光密度。以每例標(biāo)本15個(gè)視野的平均光密度的平均值作為該例的測(cè)量值。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.0軟件，采用t檢驗(yàn)以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

光鏡觀察，1周后，對(duì)照組神經(jīng)節(jié)中的細(xì)胞清晰可見，核大而圓。核仁明顯，胞質(zhì)中可見粗大尼氏小體，有髓神經(jīng)纖維清晰可見（插頁(yè)圖1）。乙醇組神經(jīng)節(jié)中部分或大部分細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核縮小，染色加深，偏位，同時(shí)有較大空泡形成。50%乙醇組見小量神經(jīng)元的核仁消失，小量髓鞘消失。75%乙醇組、100%乙醇組大部分神經(jīng)元核仁消失，而胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體變細(xì)，髓鞘大部分消失（插頁(yè)圖2～4）。3個(gè)月后，三組不同濃度乙醇組神經(jīng)節(jié)鏡下觀與1周相似（插頁(yè)圖5～7）。

圖像分析結(jié)果顯示，與手術(shù)對(duì)照組比較，乙醇組尼氏體染色平均光密度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與50%乙醇組比較，75%乙醇組、100%乙醇組1周、3個(gè)月尼氏小體光密度值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；75%乙醇組與100%乙醇組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各濃度乙醇組組內(nèi)1周和3個(gè)月比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1～2。

表1 1周后對(duì)照組與乙醇組尼氏小體光密度比較（）

表1 1周后對(duì)照組與乙醇組尼氏小體光密度比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01

表2 各濃度乙醇組1周、3個(gè)月尼氏小體光密度比較（）

表2 各濃度乙醇組1周、3個(gè)月尼氏小體光密度比較（）

注：與50%乙醇組比較，*P＜0.05

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4 討 論

尼氏小體是神經(jīng)元內(nèi)一種特殊的結(jié)構(gòu)[3]，由大量平行排列的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和雜夾其的核糖核蛋白體構(gòu)成。尼氏體的主要功能是合成蛋白質(zhì)，供給神經(jīng)細(xì)胞的活動(dòng)，神經(jīng)細(xì)胞功能旺盛時(shí)，胞體要有相應(yīng)的體積進(jìn)行必要的代謝活動(dòng)，其所需蛋白質(zhì)越多，尼氏體也越粗大，當(dāng)神經(jīng)元受損害時(shí)，尼氏小體即漸漸分解以至消散。因此，尼氏小體結(jié)構(gòu)的變化可作為神經(jīng)元受損的標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)通過尼氏小體染色方法和檢測(cè)尼氏小體平均光密度來觀察尼氏小體的結(jié)構(gòu)變化，以進(jìn)一步研究乙醇對(duì)腹腔神經(jīng)叢的破壞程度。

乙醇組尼氏體平均光密度較手術(shù)對(duì)照組明顯降低（P＜0.05），說明乙醇組尼氏體平均光密度的降低是非手術(shù)損傷破壞引起。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果在腹腔神經(jīng)叢毀損后的第1周、3個(gè)月，50%乙醇組與75%乙醇組、100%乙醇組光鏡下觀有較大差別。鄭漢光等[4]在離體試驗(yàn)光鏡下中觀察到，浸于50%、75%、100%三種不同濃度乙醇1周后組織學(xué)變化相似，均見核仁消失，尼氏小體均變細(xì)，神經(jīng)纖維髓鞘全部消失，說明乙醇濃度與最終組織學(xué)變化關(guān)系不大。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不盡相同，我們認(rèn)為活體動(dòng)物的腹腔與離體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境不同，乙醇本身具有高揮發(fā)性，腹腔神經(jīng)叢周圍有大血管，并且乙醇在注入后被體液所稀釋，濃度和容量可能會(huì)降低，并不能完全做到飽和浸潤(rùn)。據(jù)矢吹俊一等報(bào)道[5]50%乙醇是能夠破壞腹腔神經(jīng)叢的最低濃度，我們觀察到75%乙醇組和100%乙醇組尼氏體平均光密度值較50%乙醇組明顯下降（P＜0.05），而75%乙醇組與100%乙醇組之間尼氏體平均光密度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示75%乙醇已能達(dá)到無水乙醇的毀損效果，50%乙醇還有所欠缺?？赡艿臋C(jī)制是[6-7]：50%乙醇雖然滲透良好，但其脫水和變性作用弱，毀損不夠徹底；理論上乙醇的濃度越高，毀損作用越強(qiáng)，但無水乙醇因其高濃度可使細(xì)胞膜蛋白質(zhì)凝固，妨礙乙醇的內(nèi)向滲透，而75%乙醇不僅滲透性良好，而且對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的脫水及變性作用也強(qiáng)，因而兩者毀損效果相似。各濃度乙醇組組內(nèi)1周和3個(gè)月尼氏體染色平均光密度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明不同濃度乙醇濃度對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成的破壞程度可能不同，但一旦破壞是不可逆的，由此可見，臨床上在腹腔神經(jīng)叢毀損一段時(shí)間后又出現(xiàn)疼痛復(fù)發(fā)，并非是神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)，功能恢復(fù)所致。可能有以下原因[8]：①隨著病情的進(jìn)一步惡化，晚期腫瘤除侵犯腹腔神經(jīng)叢外，也侵犯其他神經(jīng)傳導(dǎo)途徑。②穿刺位置不精確準(zhǔn)確、腹腔神經(jīng)叢所在區(qū)域被腫瘤繞或淋巴結(jié)占據(jù)，乙醇的彌散不良，毀損不夠徹底，未遭到毀損的腹腔神經(jīng)功能代償疼痛可復(fù)發(fā)。

通過本研究我們認(rèn)為50%乙醇、75%乙醇和100%乙醇對(duì)兔腹腔神經(jīng)叢均有不同程度的變性作用，但以75%乙醇濃度適宜，且遠(yuǎn)期效果明確。75%乙醇能在確保阻滯療效前提下，可最大限度減少無水乙醇帶來的不良反應(yīng)，對(duì)臨床有一定的指導(dǎo)意義。

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［3］韓濟(jì)生，關(guān)新民.醫(yī)用神經(jīng)生物學(xué)［M］.武漢：武漢出版社，1996：3.

［4］鄭漢光，汪國(guó)香，陶凡.腹腔神經(jīng)節(jié)（叢）乙醇阻滯治療癌性腹痛的臨床和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織學(xué)的初步觀察［J］.河北醫(yī)學(xué)，1999，5（1）：12-15.

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不同濃度乙醇對(duì)活體家兔腹腔神經(jīng)叢毀損的組織學(xué)觀察

王 振 曲丕盛 陶 凡 鄭漢光 杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院麻醉疼痛科 杭州310003

Histological Changes of Neurolytie Celiac-Plexus Block with Various Concentrations of Alcohol in Rabbits

WANG Zhen，QU Pisheng，TAO Fan，ZHENG Hanguang. Department of Anesthesiology,Zhejiang Hangzhou Red Cross Hospital,Hangzhou(310003),China

ObjectiveTo observe the relationship between histological changes of neurolytie celiac-plexus block and concentrations of alcohol，in order to provide scientific evidence for clinical application.MethodsForty-eight New Zealand rabbits were randomly divided into 4 groups：control group，50%alcohol group，75%alcohol group，and 100%alcohol group（n=12）.Control group was given saline.Eighteen rabbits from alcohol groups（n=6 from each group）were sacrificed one week after administration of alcohol and the rest ones were sacrificed at three month for histological examination.The Nissl body in celiac plexus blocked with alcohol or from the other side without treatment were stained with Thionine.HPIAS-1000 system was used to detect OD values of the Nissl body.ResultsAfter one week，no abnormality in gangliocytes in tissue sections from control groups was seen；few disappearance of nucleus in neurons was seen in 50%alcohol group；and the majority of nucleus in neurons disappeared in 75%alcohol group and 100%alcohol group，with smaller Nissl body and demyelination.After three months，the histological changes of alcohol groups were similar to those at one week.The OD values of the Nissl body in alcohol groups were lower than that in control group（P＜0.01）；the OD values of the Nissl body in 75%alcohol group and 100% alcohol group were lower than that in 50%alcohol group at one week and three months（P＜0.05）.No significant difference in OD values of the Nissl body was noted between 75%alcohol group and 100%alcohol group（P＞0.05）.No significant difference was found between one week and three months in each group（P＞0.05）.ConclusionThe histological changes of neurolytie celiac-plexus block was related to the concentration of alcohol.75%alcohol may be the suitable one for clinical use.

rabbits；alcohol；celiac plexus；block；histological observation

杭州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2007B0042）

2013-12-09

2014-02-17