pB2R-Venus重組真核載體的構(gòu)建及在HEK293T細胞中的表達*

季丙元 程葆華 王春梅 陳 京△ 白 波△

(1濟寧醫(yī)學院神經(jīng)生物學研究所,山東 濟寧 272067；2山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,山東 泰安 272018)

激肽是重要的促炎癥多肽，由激肽釋放酶作用于激肽原產(chǎn)生，酶解產(chǎn)物緩激肽和胰激肽主要通過緩激肽2型受體(bradykinin receptor 2,B2R)起作用。B2R是一種G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptors，GPCRs)，能調(diào)節(jié)心血管平衡、增加血管通透性[1]和NO的釋放[2]，同時還能促進炎癥反應和傷害性效應，B2R目前已成為重要的藥物靶標。近年來，有關GPCR二聚化或寡聚化的研究日益增多[3-4]，本實驗構(gòu)建的pB2R-Venus真核表達載體可通過生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(bioluminescence resonance energy transfer，BRET)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)或雙分子熒光互補等研究技術發(fā)揮作用，用來研究BDKRB2同其他受體或蛋白間的相互作用，也可用于研究受體的脫敏、內(nèi)化、泛素化等過程，闡明受體作用的機制，從而有助于進一步探討其作為藥物靶標的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

含人B2R全長cDNA基因序列的重組載體pcDNA3.1-B2R和含Venus編碼序列的重組載體(Clontech公司)。DNA聚合酶、T4 DNA連接酶和限制性核酸內(nèi)切酶均購自Fermentas公司，PCR產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠膠回收試劑盒及無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提及小提試劑盒均購自北京天根生物有限公司；HEK293T細胞系為實驗室保存；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。引物由上海生工生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1目的基因的獲取及引物設計 登錄Genebank獲取人BDKRB2(B2R) cDNA序列(AY275465)，根據(jù)B2R序列特點和pVenus-N1的序列特點設計引物，并在引物末端引入酶切位點。由引物設計軟件Primer5.0設計出引物，正向引物序列為：5’-CCCGAATTCACCATGTTCTCTCCCTGGAAGATATCA-3’(含EcoRⅠ酶切位點)，反向引物序列為：5’-CGCGGATCCGCCTGTCTGCTCCCTGCCCAGTC-3’(含BamHⅠ酶切位點)。

1.2.2重組真核表達載體pB2R-Venus的構(gòu)建 以pcDNA3.1-BDKRB2為模板進行PCR反應，反應體系總體積為50μl，其中模板2μl，上下游引物各1μl，2×EasyTaq superMix 25μl，余則用超純水補足。反應條件：95℃ 預變性1min，然后95℃ 45s，65℃ 45s，72℃ 90s，共32個循環(huán)，然后72℃延伸10min，瓊脂糖凝膠電泳，獲得約1.2Kb大小的目的片段，膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和表達載體pVenus-N1。酶切后的PCR產(chǎn)物和pVenus-N1電泳、膠回收，T4DNA連接酶室溫連接4h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，37℃ LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，挑取單克隆，搖菌過夜，質(zhì)粒提取后用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定構(gòu)建結(jié)果是否正確。將酶切正確的質(zhì)粒送上海生工公司測序。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染 HEK293T細胞常規(guī)(37℃，5%CO2，10%胎牛血清)培養(yǎng)、傳代。將狀態(tài)良好的、處于對數(shù)生長期的細胞按1×106個 /孔接種至6孔板中，待細胞長至90%融合時，將培養(yǎng)基換成不含血清的DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒。實驗分為兩組：對照組(僅轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒pVenus-N1)和轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pB2R-Venus)，具體轉(zhuǎn)染方法參照轉(zhuǎn)染試劑說明書進行。轉(zhuǎn)染后6 h，換成新鮮的含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4pB2R-Venus重組表達載體在HEK293T細胞中的表達檢測 1)熒光顯微鏡:轉(zhuǎn)染后36 h，將培養(yǎng)有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒細胞的6孔培養(yǎng)板直接放在顯微鏡下觀察。2)Western blot:轉(zhuǎn)染后 48 h,收集各組細胞，加入適量RIPA裂解液，置冰上裂解30 min，其他按常規(guī)方法操作[5]。提取后的蛋白，進行Western blot檢測?？笲2R一抗按1∶1000 稀釋，β-actin小鼠單克隆抗體作內(nèi)參，1∶1000稀釋。辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠 IgG 作二抗，1∶5000稀釋，ECL化學發(fā)光顯影。

2 結(jié)果

2.1 pB2R-Venus重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以pcDNA3.1-B2R為模板，經(jīng)PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴增產(chǎn)物長度為1176 bp，與人B2R基因長度相等。見圖1。重組表達載體pB2R-Venus經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，電泳結(jié)果顯示重組質(zhì)粒被切成長度較大的載體片段和長度約為1200 bp的DNA片段，初步說明質(zhì)粒構(gòu)建正確。見圖2。重組質(zhì)粒pB2R-Venus測序圖譜和序列結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒序列與人B2R全長cDNA完全一致，說明質(zhì)粒構(gòu)建正確。見圖3。

圖1 PCR擴增人B2R基因片段

圖2 重組質(zhì)粒pB2R-Venus被EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切

圖3 重組質(zhì)粒pBDKRB2-Venus測序圖譜

2.2 熒光顯微鏡檢測重組質(zhì)粒在HEK293T細胞中的表達

熒光顯微鏡觀察重組質(zhì)粒pB2R-Venus在HEK293T細胞中的表達情況，結(jié)果表明，對照組細胞，即只轉(zhuǎn)染表達質(zhì)粒pVenus-N1的細胞，細胞質(zhì)內(nèi)部呈現(xiàn)均勻的黃色(圖4a)，而轉(zhuǎn)染新構(gòu)建重組質(zhì)粒pB2R-Venus的細胞只在質(zhì)膜部位發(fā)出黃色熒光(圖4b)，說明在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pB2R-Venus的HEK293T細胞中，受體B2R表達較強烈，且僅表達于質(zhì)膜。而在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細胞中，沒有受體B2R的表達，進一步說明載體構(gòu)建正確且表達效率較高。

同樣，蛋白印跡結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pB2R-Venus的細胞中,出現(xiàn)兩條帶，其中一條分子量為44 kDa,與受體B2R的大小相同；而在僅轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pVenus-N1的對照細胞中，沒有目的蛋白的表達(圖 5) ，說明空白細胞或?qū)φ占毎?，不表達目的基因。

a：轉(zhuǎn)染pVenus-N1載體的細胞；b：轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pB2R-Venus的細胞

A：pB2R-Venus的表達 B：β-actin的表達Lane 1：轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pB2R-Venus的細胞Lane 2：僅轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細胞

圖5 Western Blot檢測重組質(zhì)粒的表達

3 討論

增強型黃色熒光蛋白(enhanced yellow fluorescent proteins，EYFP)是黃色熒光蛋白的突變體，由于其高靈敏性等優(yōu)點，目前被廣泛應用于眾多實驗研究。但EYFP的抗酸性差，且對鹵化物敏感，因此其應用仍有諸多局限。在EYFP基礎上改進的突變體Venus[6]熒光更亮，耐酸性更強，更穩(wěn)定，且成熟更快，其應用將更加廣泛，可作為生物傳感器應用在相應組織和器官上?；谝陨蟽?yōu)點，Venus是目前應用最多的黃色熒光蛋白探針，可用于FRET實驗，作為熒光蛋白配對、鈣離子檢測、雙分子熒光互補等實驗研究。本實驗構(gòu)建的pB2R-Venus融合蛋白，Venus作為標簽蛋白不影響目的蛋白的折疊和運輸，直接通過熒光顯微鏡就可觀察受體在活細胞中的表達、內(nèi)吞等動態(tài)過程。同時Venus熒光性質(zhì)穩(wěn)定，熒光強度不易受到細胞內(nèi)其他物質(zhì)的干擾，，從而使目的蛋白的檢測更快、更簡便、靈敏度更高、重現(xiàn)性更好。

激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(kallikrein-kinin system，KKS)是重要的內(nèi)源性調(diào)控途徑，可參與血壓調(diào)節(jié)、炎癥、心血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)、鎮(zhèn)痛反應、疼痛傳遞、細胞因子釋放、前列腺素和NO合成以及細胞增殖等生理學過程[7]。激肽釋放酶作用于激肽原釋放緩激肽(bradykinin，BK)，BK羧基末端的精氨酸水解后可生成Des-Arg9BK。BK與組成型表達的B2R親和力較高，而Des-Arg9BK與誘導性表達的B1R親和力較高[8]。B2R是GPCRs超家族的成員之一，而GPCRs是眾多藥物的作用靶點，是治療疼痛、高血壓、心血管疾病、帕金森等疾病的藥物靶標。

實驗選用的HEK293T細胞是永生化的細胞，轉(zhuǎn)染效率高且本身不表達B2R蛋白，因此常用做轉(zhuǎn)染的受體細胞檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的表達。本實驗構(gòu)建的融合表達載體pB2R-Venus轉(zhuǎn)染細胞后，熒光顯微鏡檢測顯示熒光蛋白表達于質(zhì)膜，標簽蛋白作為融合蛋白與受體B2R自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成后轉(zhuǎn)運至質(zhì)膜。同時，Western blot也顯示在未轉(zhuǎn)染的細胞中沒有受體的表達，而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細胞中受體蛋白水平有較強的表達。實驗構(gòu)建的pB2R-Venus真核表達載體可用于后續(xù)的BRET或FRET實驗，以研究受體間或受體與G蛋白、GRK以及arrestin等的相互作用[9-10]，同時還能用于動態(tài)觀察受體在膜表面的表達、內(nèi)吞及胞內(nèi)運輸過程。

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