甘薯中清除不同自由基的活性物質提取條件的優(yōu)化

張志雯，秦素平，陳于和，喬亞科，武寶悅

(河北科技師范學院生命科技學院, 河北 秦皇島，066600)

D.Harman提出的自由基衰老學說認為，機體衰老與體內自由基增多有關，自由基能從多方面對機體造成損傷，加速機體衰老[1～3]。自由基過多或清除過慢，還會誘發(fā)各種疾病[4～6]。隨著人們對生活質量的要求不斷提高和綠色環(huán)保消費意識的增強，天然的清除自由基的活性物質的研究，特別是將其應用于食品、醫(yī)藥保健品和化妝品等行業(yè)，日益成為研究的熱點[7～10]。甘薯不僅具有很高的營養(yǎng)價值，同時還含有多種生物活性物質，具有獨特的生理保健作用和藥用價值，倍受國內外研究者的關注[11～14]，關于其清除自由基活性物質的研究也有不少報道，其清除自由基的活性物質有多糖、多酚等[15～17]。目前針對清除特定自由基活性物質的研究還少有報道。由于自由基種類繁多而且代謝過程非常復雜[18，19]，針對不同的自由基，尋找特定的清除劑有利于提高自由基的清除率。

筆者分別針對清除羥自由基和超氧陰離子自由基的兩類不同的活性物質，探討了溶劑、提取溫度、提取時間和提取劑用量對其自由基清除率的影響，以獲取最佳的提取工藝條件，為羥自由基清除劑和超氧陰離子自由基清除劑的開發(fā)利用以及更好地利用甘薯中的活性物質提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

盧選1號甘薯，為本課題組引種保存。

1.2 方法

1.2.1甘薯中清除自由基活性成分的提取 甘薯→洗凈→去皮→切片→烘干至恒質量→粉碎→過篩(國家標準篩,篩孔尺寸0.5 mm，)得到甘薯粉，分別稱取0.2 g甘薯粉放入試管，加入不同的提取溶劑進行提取，提取上清液進行相關指標的測定。

1.2.2羥自由基清除率的測定 參照洪宗國等[20]的方法，略有改動。在試管中依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL，不同的提取液2 mL，6 mmol/L H2O2溶液2 mL，搖勻，靜置10 min；再加入6 mmol/L水楊酸溶液2 mL，搖勻，靜置30 min后，于波長510 nm處測定其吸光度值A。清除率計算公式如下：

清除率=[(A空白-A樣品+A校正)/A空白]×100%

式中：A空白為空白對照液的吸光度值，A樣品為加入樣品提取液后的吸光度值，A校正為不加顯色劑H2O2樣品提取液本底的吸光度值。

1.2.3超氧陰離子自由基清除率的測定 參照洪宗國等[20]的方法，略有改動。取50 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖溶液4.5 mL和不同的提取液0.1 mL，置于25 ℃水浴中預熱20 min。加入25 ℃水浴中預熱的2.5 mmol/L的鄰苯三酚0.4 mL，混勻后置于25 ℃水浴中反應5 min，立即加入8.0 mol/L的HCl 0.1 mL終止反應。用去離子水調節(jié)儀器的零點，于320 nm處測定吸光度值。空白組以0.1 mL去離子水代替樣品。清除率計算公式如下：

清除率=[(A空白-A樣品+A校正)/A空白]×100%

式中：A空白為空白對照液的吸光度值，A樣品為加入樣品提取液后的吸光度值，A校正為不加顯色劑H2O2樣品提取液本底的吸光度值。

1.2.4數據的統(tǒng)計與分析 數據用DPS(v7.05版)軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 清除羥自由基的活性物質提取條件的優(yōu)化

2.1.1提取溶劑的確定 分別以體積分數為0(水)，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00(無水乙醇)的乙醇作為提取溶劑，在提取溫度為40 ℃，提取劑用量30 mL/g條件下，提取時間3 h。結果表明：隨著提取溶劑中乙醇體積分數的不斷升高，提取液對羥自由基的清除率呈逐漸下降趨勢(圖1)；當以水作為提取溶劑時，提取液對羥自由基的清除率最高。所以，清除羥自由基活性物質的提取采用水作提取溶劑為最佳。

2.1.2溫度對清除率的影響 以水為提取溶劑，提取劑用量30 mL/g，分別在20，40，60，80，100 ℃條件下提取3 h。結果表明：當提取溫度低于40 ℃時，提取液對羥自由基的清除率隨溫度升高而升高(圖2)；40 ℃時清除率最高；當提取溫度高于40 ℃后，隨著溫度的升高，提取液對羥自由基的清除率呈逐漸下降趨勢。所以，應將提取溫度控制在大約40 ℃較為合適。

圖1 溶劑對羥自由基清除率的影響 圖2 溫度對羥自由基清除率的影響

2.1.3提取時間對清除率的影響 以水為提取溶劑，提取溫度為40 ℃，提取劑用量為30 mL/g的條件下分別提取1，2，3，4，5 h。結果表明：浸提時間在3 h內，隨提取時間的延長，提取液對羥自由基的清除率逐漸升高(圖3)；而當提取時間超過3 h后，提取液對羥自由基的清除率隨時間延長而逐漸下降。因此，提取時間應控制在大約3 h。

2.1.4提取劑用量對清除率的影響 以水為提取溶劑，提取溫度為40 ℃，提取時間為3 h的條件下，分別以提取劑用量10，20，30，40，50 mL/g進行提取。從圖4可知，結果表明：在提取劑用量10～40 mL/g范圍內，提取液對羥自由基的清除率隨用量增大而增大(圖4)；提取劑用量高于50 mL/g后，提取液對羥自由基的清除率有所下降。因此，提取劑用量應控制在大約40 mL/g。

2.1.5正交試驗 根據以上單因素試驗結果，清除羥自由基活性物質提取的最佳溶劑為水，較佳提取溫度為40 ℃，較佳提取時間為3 h，較佳提取劑用量為40 mL/g，在此基礎上設計并進行正交試驗。結果表明：清除羥自由基活性物質的最佳提取溫度為45 ℃，最佳提取時間2.5 h，最佳提取劑用量為45 mL/g(表1)。根據極差的大小，可以得到各因素對清除羥基自由基能力的影響次序由大到小依次為：提取溫度、提取時間、提取劑用量。由表2方差分析可知，提取溫度、提取劑用量和提取時間對羥自由基清除率的影響均極顯著。

圖3 提取時間對羥自由基清除率的影響 圖4 提取劑用量對羥自由基清除率的影響

表1 甘薯中清除羥自由基活性物質提取條件的正交試驗結果及直觀分析

表2 甘薯中清除羥自由基活性物質提取條件的正交試驗方差分析

注：F0.05(2,16)=3.63，F0.01(2,16)=6.23，下同。

在試驗范圍內，得到的優(yōu)化工藝組合為：以水為提取溶劑，提取劑用量45 mL/g，提取溫度45 ℃，提取時間2.5 h，此組合不在正交試驗中，將其編號為組合10。對其進行試驗驗證，將驗證結果與正交試驗結果進行比較，結果表明：用組合7，組合9，組合10等3種條件進行活性物質的提取，羥自由基清除率最高，極顯著高于其他組合，且三者差異不顯著(表3)。綜合考慮提取效率，節(jié)省時間，清除羥自由基活性物質的最佳提取工藝為：以水作為提取溶劑，提取劑用量45 mL/g，提取溫度45 ℃，提取時間2.5 h。

2.2 清除超氧陰離子自由基活性物質提取條件的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的確定 分別以體積分數為0(水)，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00(無水乙醇)的乙醇作為提取溶劑，在提取溫度為40 ℃，提取劑用量30 mL/g的條件下，提取3 h。結果表明：隨著提取溶劑中乙醇體積分數的不斷升高，提取液對超氧陰離子自由基的清除率呈逐漸上升趨勢，當以無水乙醇作為提取溶劑時，提取液對超氧陰離子自由基的清除率達到最高(圖5)。所以，清除超氧陰離子自由基活性物質的提取采用無水乙醇作提取溶劑為最佳。

表3 甘薯中清除羥自由基活性物質提取條件的正交試驗與驗證試驗結果比較

2.2.2提取溫度對超氧陰離子自由基活性物質清除率的影響 以無水乙醇為溶劑，提取劑用量30 mL/g，分別在20，40，60，80，100 ℃條件下提取3 h。結果表明：當提取溫度低于40 ℃時，提取液對超氧陰離子自由基的清除率隨溫度升高而升高(圖6)；提取溫度為40 ℃時清除率最高；當提取溫度高于40 ℃后，隨著提取溫度的升高，提取液對超氧陰離子自由基的清除率呈逐漸下降趨勢。所以，應將提取溫度控制在大約40 ℃較為合適。

圖5 溶劑對超氧陰離子自由基清除率的影響 圖6 溫度對超氧陰離子自由基清除率的影響

2.2.3提取時間對超氧陰離子自由基活性物質清除率的影響 在無水乙醇為提取溶劑，溫度為40 ℃，提取劑用量為30 mL/g的條件下分別提取1，2，3，4，5 h。結果表明：浸提時間在3 h內，隨提取時間的延長，提取液對超氧陰離子自由基的清除率逐漸升高(圖7)；而當提取時間超過3 h后，提取液對超氧陰離子自由基的清除率隨時間延長而逐漸下降。因此，提取時間應控制在大約3 h。

2.2.4提取劑用量對超氧陰離子自由基活性物質清除率的影響 在無水乙醇為提取溶劑，提取溫度為40 ℃，提取時間為3 h的條件下，分別以提取劑用量10，20，30，40，50 mL/g進行提取。結果表明：提取劑用量在10～30 mL/g范圍內，提取液對超氧陰離子自由基的清除率隨提取劑用量增大而增大(圖8)；提取劑用量高于30 mL/g后，提取液對超氧陰離子自由基的清除率有所下降。因此，提取劑用量應控制在大約30 mL/g。

2.2.5正交試驗 根據以上單因素試驗結果，清除超氧陰離子自由基活性物質提取的最佳提取溶劑為無水乙醇，較佳提取溫度為40 ℃，提取時間為3.0 h，提取劑用量為30 mL/g，在此基礎上設計并進行正交試驗。結果表明：清除超氧陰離子自由基活性物質的最佳提取溫度為45 ℃，最佳提取時間3.0 h，最佳提取劑用量為35 mL/g(表4)。由極差的大小，可以得到各因素對超氧陰離子基自由基清除能力的影響次序由大到小依次為：提取溫度，提取劑用量，提取時間。由表5方差分析可知，提取溫度、提取劑用量和提取時間對羥自由基清除率的影響均極顯著。

在試驗范圍內，得到的優(yōu)化工藝組合為：以無水乙醇為提取溶劑，提取劑用量35 mL/g，提取溫度45 ℃，提取時間3.0 h，這與表4中的組合9一致。將正交試驗結果進行多重比較，結果表明，用組合9進行活性物質的提取，所得提取液對超氧陰離子自由基的清除率最高，顯著高于其他組合(p<0.05)。所以，清除超氧陰離子自由基活性物質的最佳提取工藝為：以無水乙醇作為提取溶劑，提取劑用量35 mL/g，提取溫度45 ℃，提取時間3.0 h。

圖7 提取時間對超氧陰離子自由基清除率的影響 圖8 提取劑用量對超氧陰離子自由基清除率的影響

表4 甘薯中清除超氧陰離子自由基活性物質正交試驗結果及直觀分析

表5 甘薯中清除超氧陰離子自由基活性物質正交試驗方差分析

3 結論與討論

本次研究結果表明，甘薯中清除羥自由基活性物質的最佳提取工藝為：以水作為提取溶劑，提取劑用量35 mL/g，提取溫度45 ℃，提取時間2.5 h；甘薯中清除超氧陰離子自由基的活性物質的最佳提取工藝為：以無水乙醇為提取溶劑，提取劑用量35 mL/g，提取溫度45 ℃，提取時間3.0 h。清除不同自由基活性物質的最佳提取條件存在差異。

黃洪光[21]的研究結果表明，甘薯中的酚酸具有抗氧化活性；李利華等[16]的研究結果表明，甘薯多糖具有抗氧化活性。本次研究從不同的角度，即從清除不同自由基能力的角度研究甘薯活性物質的最佳提取工藝。結果表明，甘薯中的活性物質具有清除羥自由基和超氧陰離子自由基的能力，前者的最佳提取溶劑是水，而后者的最佳提取溶劑是無水乙醇。這可能是因為兩類活性物質主要成分及性質存在差異造成的，這也說明甘薯中不同的活性物質對不同的自由基有不同的清除效果。所以，在利用甘薯的抗氧化活性時，應根據不同的自由基選擇不同的提取溶劑。

清除羥自由基活性物質和清除超氧陰離子自由基活性物質的提取率，均隨提取溫度的升高呈先升后降的趨勢，且均在40 ℃時達到最大值；隨著提取溫度的進一步升高，清除率均逐漸下降。這可能是由于隨著溫度升高，清除自由基的活性物質會出現降解，從而影響清除率。但二者的下降幅度不同，超氧陰離子自由基的清除率下降的更為明顯。這也說明了兩類活性物質主要成分及性質的不同。關于甘薯中清除羥自由基和清除超氧陰離子自由基兩類活性物質的主要活性成分及其含量有待于進一步研究分析。

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