消渴脂平膠囊對糖尿病大鼠脂肪組織MCP-1影響的研究

單國輝李 偉

(1長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，長春130021；2黑龍江省佳木斯市中醫(yī)院，佳木斯154002)

消渴脂平膠囊對糖尿病大鼠脂肪組織MCP-1影響的研究

單國輝1李 偉2

(1長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，長春130021；2黑龍江省佳木斯市中醫(yī)院，佳木斯154002)

目的 本研究主要觀察消渴脂平膠囊對高脂飼料與鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型脂肪組織MCP-1表達(dá)水平的影響。方法 復(fù)制糖尿病大鼠模型分為正常組、模型組、消渴脂平組及馬來酸羅格列酮組。灌胃8周后采用免疫組化技術(shù)，從蛋白水平觀察各組脂肪組織中MCP-1表達(dá)的情況。結(jié)果 ①消渴脂平膠囊可降低大鼠FPG及CRP水平。②糖尿病大鼠脂肪組織中MCP-1蛋白表達(dá)情況：正常組脂肪組織MCP-1表達(dá)強度較弱、范圍小；模型組脂肪組織MCP-1表達(dá)顯著增強；馬來酸羅格列酮組脂肪組織MCP-1表達(dá)較模型組減弱；消渴脂平膠囊組脂肪組織MCP-1表達(dá)較模型組減弱，與馬來酸羅格列酮組接近。半定量分析結(jié)果顯示：正常組局部弱染，模型組彌漫性染色增強，馬來酸羅格列酮局部染色趨強，消渴脂平膠囊組局部弱染，顯著低于模型組。結(jié)論 ①消渴脂平膠囊具有降糖和改善炎癥狀態(tài)的作用。②糖尿病大鼠脂肪組織中MCP-1蛋白表達(dá)水平升高，提示MCP-1可能是促進(jìn)肥胖T2DM發(fā)生發(fā)展的重要炎癥因素；消渴脂平膠囊可降低糖尿病大鼠脂肪組織中MCP-1蛋白表達(dá)。

消渴脂平膠囊；脂肪組織；MCP-1；糖尿??；中醫(yī)藥療法

現(xiàn)代研究表明，T2DM是一種自然免疫和慢性低度炎癥性疾病，與臨床常見的病毒、細(xì)菌引起的炎癥反應(yīng)不同，它是機(jī)體的一種微炎癥狀態(tài)。但其具體作用在哪個靶器官及其作用機(jī)制，尚未明確。近些年來研究表明，單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)在T2DM脂肪組織炎癥發(fā)病中起著重要作用。隨著社會的發(fā)展，糖尿病的病機(jī)由陰虛燥熱逐漸演變?yōu)闅怅巸商搾短叼?，因此治療上?yīng)以益氣養(yǎng)陰、化瘀瀉濁為主。

本實驗以高脂飼料與鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型為實驗對象，觀察消渴脂平膠囊對血糖、CRP的影響，并采用免疫組化從蛋白水平觀察各組大鼠脂肪組織中MCP-1表達(dá)的情況，以初步探討T2DM的脂肪組織炎癥反應(yīng)，揭示消渴脂平膠囊在炎癥方面的作用，以豐富T2DM的炎癥機(jī)制學(xué)說，進(jìn)一步闡釋現(xiàn)代消渴“氣陰兩虛挾痰瘀”病機(jī)理論，為中醫(yī)藥防治T2DM提供新的途徑及臨床藥物，并為深入探討T2DM的炎癥發(fā)病機(jī)制提供理論及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇清潔級4周齡雄性Wistar大鼠48只，體質(zhì)量(200±20)g，由吉林大學(xué)動物實驗質(zhì)量檢測中心提供，許可證編號：SCx K-(吉)2007-0003。大鼠在吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心無特定病原體(specific pathogen-free，SPF)級動物飼養(yǎng)房每籠5只飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在22-25°C，濕度為55±5%，12／12小時光照黑暗循環(huán)(光照時間7：00-19：00)，自由獲取食物和飲水。

1.2 實驗藥物

1.2.1 消渴脂平膠囊 由山楂、何首烏、黃精、葛根、人參、澤瀉、桑葉組成。長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心提供。

1.2.2 馬來酸羅格列酮片（文迪雅） 葛蘭素史克(天津)有限公司提供，批號：國藥準(zhǔn)字H20020475。

1.2.3 鏈脲佐菌素（STZ） 德國Sigma公司生產(chǎn)。用時配成2%STZ溶液，按30mg／kg對大鼠進(jìn)行腹腔注射。

1.3 高脂飼料配方 糖類占20%，豬油占10%，膽固醇占2%，膽酸鹽占0.5%，普通飼料占67.5%。

1.4 主要儀器 ①DG-3022A酶聯(lián)免疫檢測儀(國營華東電子管廠)；②日立7150型生化自動分析儀(日本)。

1.5 主要試劑 ①Rabbit Anti-MCP-1：北京博奧森生物技術(shù)有限公司；②多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)：福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；③S-P超敏試劑盒(鼠／兔)：福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；④DAB顯色試劑盒：福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.6 實驗方法

1.6.1 分組 選擇Wister大鼠48只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表分成正常組12只和高脂組36只。正常組喂普通飼料，高脂組喂飼高脂飼料。4周后參照Srinivasan等［1］和周迎生等［2］的方法造模，腹腔注射2%鏈脲佐菌素30mg／kg，腹腔注射等體積的0.1mol·L-1無菌枸櫞酸緩沖液。所有大鼠于72h時眼眶取血，分離血清，-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?，待測FPG、CRP。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、消渴脂平膠囊組、馬來酸羅格列酮組，每組12只，每籠5只。分組后每天定時灌胃1次。消渴脂平膠囊組按3.6g／kg·d，馬來酸羅格列酮組按4mg／kg·d灌胃，正常組及模型組均給予等體積蒸餾水灌胃。給藥8周后將大鼠處死取脂肪組織，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1.6.2 Wistar大鼠DM診斷標(biāo)準(zhǔn) 腹腔注射鏈脲佐菌素7天后禁食不禁水12h，尾靜脈取血，以Accu-chekAdvantage血糖儀測定血糖值。以血糖峰值＞16.7mmol／L診斷為DM。

1.6.3 一般狀態(tài)觀察 包括動物精神狀態(tài)、毛色、死亡等情況。

1.6.4 血清FPG、CRP檢測 灌胃結(jié)束后，大鼠隔夜禁食不禁水12h，次晨眼球取血，靜置2小時后，3000r／min離心20分鐘后，分離血清，移至-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)洹?/p>

1.6.5 MCP-1蛋白檢測 ①采用免疫組織化學(xué)染色法檢測MCP-1蛋白表達(dá)情況。②脂肪組織MCP-1蛋白表達(dá)半定量評分：每只動物隨機(jī)觀察20個不重復(fù)的100倍視野，按脂肪細(xì)胞染色區(qū)域和染色強度分為0～4分：0分為無染色或染色極弱；1分為局部弱染，染色區(qū)＜25%；2分為局部染色趨強，染色區(qū)25%～50%；3分為彌漫性染色增強，染色區(qū)51%～75%；4分為彌漫性強染色，染色區(qū)＞75%。

綜合免疫組化染色區(qū)域大小和染色強度，判定評分。

1.7 統(tǒng)計方法 采用SPSS13.0軟件作統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，服從正態(tài)分布的兩組間均數(shù)比較用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計，同批次多組間比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA)，兩兩比較采用最小顯著差法(LSD)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 實驗期間死亡動物9只，其中正常組1只，消渴脂平膠囊組2只，馬來酸羅格列酮組2只，模型組4只。正常組大鼠生長良好，無其他癥狀。模型組大鼠較其他三組肥胖，活動遲緩、懶動、毛色干枯無光澤。

2.2 C-反應(yīng)蛋白的比較 實驗周期內(nèi)，模型組顯著高于正常大鼠組，具有非常顯著性差異(P＜0.01)，消渴脂平膠囊組明顯低于模型組(P＜0.01)。馬來酸羅格列酮組與模型組相比無明顯降低(P＞0.05)。

2.3 各組血糖水平的比較 實驗周期內(nèi)，模型組顯著高于正常大鼠組(P＜0.01)，治療組明顯低于模型組(P＜0.05)，但均高于正常組(P＜0.05)。

2.4 大鼠脂肪組織中MCP-1蛋白表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果顯示：MCP-1免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，主要表達(dá)于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。正常組脂肪組織MCP-1表達(dá)強度較弱、范圍小。模型組脂肪組織MCP-1表達(dá)顯著增強。馬來酸羅格列酮組脂肪組織MCP-1表達(dá)較模型組減弱。消渴脂平膠囊組脂肪組織MCP-1表達(dá)較模型組減弱，其MCP-1表達(dá)程度與馬來酸羅格列酮組接近。

3 討論

糖尿病屬中醫(yī)“消渴病”范疇，其典型癥狀為“三多一少”。但目前臨床上許多2型糖尿病病人并沒有“三多一少”癥狀，而是以肥胖為主要表現(xiàn)，造成了消渴病與糖尿病的含義不相符合。其原因在于中醫(yī)以癥狀來命名消渴，而糖尿病的定義是以血糖值為診斷標(biāo)準(zhǔn)。消渴病的陰虛燥熱病機(jī)理論是在三消論基礎(chǔ)上提出的，并不包括無典型三多一少癥狀的糖尿病?，F(xiàn)代糖尿病患者由于社會環(huán)境因素及應(yīng)用大量降糖藥物，其“三多一少”癥狀已不明顯，而表現(xiàn)為肥胖，倦怠乏力，失眠多夢，舌質(zhì)紫暗，苔膩等氣陰兩虛挾痰瘀之象。因此現(xiàn)代消渴病的證型多以氣陰兩虛挾痰瘀為主。古代醫(yī)家治療消渴病主要以滋陰清熱為大法，但現(xiàn)代消渴病以氣陰兩虛挾痰瘀為多見，因此治療上應(yīng)以益氣養(yǎng)陰，化瘀瀉濁為主?！耙鏆怵B(yǎng)陰，化瘀瀉濁”是根據(jù)肥胖2型糖尿病病機(jī)特點所采用的具有針對性的治法。

消渴脂平膠囊(人參15g，黃精20g，何首烏20g，葛根20g，山楂15g，澤瀉10g，桑葉20g)。本方以人參為君藥。人參味甘、苦，性微溫，歸心、肺、脾經(jīng)。具有大補元氣，補脾益肺，生津止渴之功?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》謂其“補五臟，安精神”。臣以黃精、何首烏。黃精味甘，性平，歸肺、脾、腎經(jīng)。具有滋腎潤肺，補脾益氣之功?！睹t(yī)別錄》：“主補中益氣，安五臟”?！侗静菥V目》：“補諸虛，止寒熱”。《本草正義》：“補血養(yǎng)陰，而養(yǎng)脾胃是其專長”。何首烏味甘、澀，性微溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補益精血之功?！侗静菥V目》：“此物養(yǎng)血益肝，固精益腎”。此資先天以養(yǎng)后天。二藥合用共奏滋補脾腎之功。山楂味酸甘，性微溫，歸脾、胃、肝經(jīng)，入血分。具有消食化積，行氣散瘀作用。《本草綱目》：“化飲食，消肉積，痰飲”?！侗静萸笳妗罚骸吧介^健脾者，因其脾有食積，用此酸咸之味，以為消磨，俾食行而痰消”。葛根味甘、辛，性涼，歸脾、胃經(jīng)。具有生津止渴之功?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》：“主消渴，身大熱”?！端幮哉摗罚骸爸篃┛省?。桑葉味甘、苦，性寒，歸肺、肝經(jīng)?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》：“主寒熱，出汗”。澤瀉味甘、淡，性寒，歸腎、膀胱經(jīng)。具有利水滲濕，泄熱之功?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》：“消水，養(yǎng)五臟，益氣力”?！侗静菥V目》：“滲濕熱，行痰飲”。桑葉質(zhì)輕宣上焦，津液得以布散，《溫病條辨》：“治上焦如羽，非輕不舉”。葛根升發(fā)脾胃清陽之氣，清陽升，濁邪降。澤瀉利下焦之濕，三藥配伍合用，使痰濁之邪從三焦水道而出，三焦暢達(dá)，津液循于常道，與山楂合用，共奏佐藥之功。

通過本實驗表明消渴脂平膠囊可降低糖尿病大鼠血糖及CRP水平，說明消渴脂平膠囊具有干預(yù)炎癥的作用。實驗結(jié)果顯示：模型組大鼠腹腔脂肪組織中MCP-1蛋白表達(dá)及半定量水平升高，提示MCP-1可能是促進(jìn)肥胖T2DM發(fā)生發(fā)展的重要因素，但具體作用機(jī)制尚不明確。因此加大對MCP-1等炎癥因子的研究可能為防治糖尿病指明新方向。本實驗提示“氣陰兩虛挾痰瘀”是肥胖T2DM的病機(jī)核心，“益氣養(yǎng)陰、化瘀瀉濁”是肥胖T2DM的治療大法。消渴脂平膠囊可降低糖尿病大鼠脂肪組織內(nèi)MCP-1的表達(dá)，提示MCP-1是該藥的作用靶點之一，并初步證實了肥胖T2DM“氣陰兩虛挾痰瘀”病機(jī)理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)炎癥學(xué)說相符合，為進(jìn)一步探討肥胖T2DM的發(fā)病機(jī)制奠定了理論及實驗依據(jù)。

［1］Srinivasan K，iswanad B，srat L，WT7.5BX?et al.Combination of high-fat diet-fed and low-dose streptozotocin-treated rat：amodel for type 2 diabetes and pharmacological screening［J］.Pharmacol Res，2005，52(4)：313-230.

［2］周迎生，高妍，李斌，等.高脂喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素注射的糖尿病大鼠模型特征［J］.中國實驗動物學(xué)報，2005，13(3)：154-158.

Research on the impact of MCP-1 in adipose tissue of diabetic rats by Xiaokezhiping Capsules

Shan guohui1li Wei2
（1 Affiliated hospital of Changchun university of traditional Chinese medicine，Changchun，130021，China；2 Jiamusi City hospital of Traditional Chinese medcine，Jiamusi，154002，China）

Objective In this study，lipid levels observed Xiaokezhiping Capsule on high-fat diet and streptozotocin-induced diabetic rat model of adipose tissue MCP-1 expression levels.Methods Diabetic rats were divided into normal group，model group，Xiaokezhiping capsules group，Rosiglitazone maleate group.After 8 weeks，fed by immunohistochemical techniques，adipose tissue was observed in each group MCP-1 protein expression levels from.Results ①Xiaokezhiping Capsules can reduce FPG and CRP levels in rats；②MCP-1 protein expression of adipose tissue in diabetic rat：MCP-1 expression of normal adipose tissue has weak intensity，small-scale；Significantly enhanced MCP-1 expression in adipose tissue of model group；Rosiglitazone maleate group MCP-1 expression in adipose tissue compared with the model group decreased；MCP-1 expression in adipose tissue compared with the model group decreased in Rosiglitazone maleate group；MCP-1 of adipose tissue in Xiaokezhiping Capsule group compared with the model group decreased，close to rosiglitazone maleate group.Semi-quantitative analysis showed that：Its local is stained weakly in normal group，Diffuse stained strengly in model group，Its local is stained strengly in Rosiglitazone maleate group，Local weak staining in in Xiaokezhiping Capsule group was significantly lower than the model group.Conclusion ①Xiaokezhiping Capsule take a role of reducing blood sugar and improving inflammation；②It may be important to promote the development of inflammatory factors in obese T2DM，because MCP-1 protein levels of adipose tissue in diabetic rat increased.Xiaokezhiping Capsule can reduce Capsule MCP-1 protein expression in adipose tissue of diabetic rats.

Xiaokezhiping Capsules；Adipose tissue；MCP-1；Diabetes；Traditional Chinese medicine therapy

10.3969／j.issn.1672-2779.2014.03.098

1672-2779(2014)-03-0151-03

蘇 玲文校對：樸春麗

2013-10-08)