對小干擾RNA長期作用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠抑制乙肝病毒復(fù)制的評價(jià)①

張衛(wèi)云 孫朝暉 任廣立 石玉玲 李 薇 張 蓉 唐榮芝(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州510010)

對小干擾RNA長期作用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠抑制乙肝病毒復(fù)制的評價(jià)①

張衛(wèi)云 孫朝暉 任廣立②石玉玲 李 薇 張 蓉 唐榮芝(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州510010)

目的:探討小干擾RNA長期作用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠對抑制乙肝病毒復(fù)制的評價(jià)。方法:siRNA表達(dá)載體經(jīng)尾靜脈注射轉(zhuǎn)染HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，設(shè)立特異性 siRNA組(pSilencer5.1/C2、pSilencer4.1/C2、pSilencer3.1/C2)、PBS對照組和陰性質(zhì)粒對照組(n=10)。在注射后第6天、21天、1個月、3個月、6個月和9個月的不同時間經(jīng)其內(nèi)眥靜脈采血，采用化學(xué)發(fā)光法定量檢測小鼠血清中HBsAg水平，實(shí)時熒光定量PCR法檢測HBV-DNA水平。結(jié)果:siRNA長期作用機(jī)體可使轉(zhuǎn)基因小鼠血清HBsAg和HBV-DNA水平顯著降低，特異性siRNA組與PBS對照組相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而陰性質(zhì)粒對照組與PBS組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論:基于載體的特異性siRNA長期作用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠可抑制HBV的復(fù)制和表達(dá)，該抑制作用是特異性的。

小干擾RNA;HBV轉(zhuǎn)基因小鼠;乙肝病毒

乙型肝炎病毒(HBV)感染已成為嚴(yán)重威脅全球健康的主要問題之一，目前全球慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者已超過4億，約有15% ～25%的感染者最終可能死于HBV相關(guān)疾病，每年有100萬人死于HBV感染所導(dǎo)致的肝硬化、重型肝炎及肝細(xì)胞癌等。中國是HBV感染的高發(fā)地區(qū)，HBV乙肝表面抗原攜帶者占全國人口的10% ～15%。目前，針對慢性乙肝肝炎的抗病毒治療主要采用重組干擾素和以拉米夫定和阿德福韋為代表的核苷類似物，但是迄今為止，其治療效果卻不能讓人滿意，并伴有嚴(yán)重的副作用，停藥后的反彈和耐藥株的出現(xiàn)仍然是亟待解決的難題。反義核酸、核酶的研究開啟了基因治療HBV感染的序幕，雖然目前這些基因治療技術(shù)仍不能徹底清除HBV病毒，但作為基因治療之一的RNAi已被證實(shí)是一非常有開發(fā)前景的抗HBV治療手段之一[1，2]。因此，本文用 siRNA 表達(dá)載體經(jīng)微靜脈長期注射HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，觀察小鼠HB-sAg濃度和乙肝病毒復(fù)制水平的變化，評價(jià)小干擾RNA(siRNA)對乙型肝炎病毒(HBV)感染的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 HBV全基因轉(zhuǎn)基因小鼠50只，購自解放軍第458醫(yī)院全軍傳染病中心。小鼠體重(20±2)g，8～10周齡，雌雄分籠，運(yùn)至本實(shí)驗(yàn)室后置于相對清潔環(huán)境飼養(yǎng)，穩(wěn)定2周后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分為特異性 siRNA 組(pSilencer5.1/C2、pSilencer 4.1/C2、pSilencer3.1/C2)、陰性質(zhì)粒對照組和 PBS對照組，每組10只小鼠。

1.2 載體和主要試劑 從既往研究構(gòu)建的載體[3-5]中選擇 pSilencer5.1/C2、pSilencer 4.1/C2組、pSilencer 3.1/C2三種載體;小鼠血清HBsAg抗原定量檢測用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測法，儀器為雅培Abbott i2000 SR全自動化學(xué)發(fā)光儀及原裝試劑。HBV-DNA定量檢測采用羅氏(LightCycler 480)實(shí)時熒光定量擴(kuò)增儀，試劑為上海科華有限公司生產(chǎn)的HBV-DNA定量試劑盒。使用羅氏(LightCycler 480) PCR分析儀方法實(shí)時熒光PCR技術(shù)進(jìn)行定量檢測，采用中山大學(xué)達(dá)安基因試劑盒進(jìn)行定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測。

1.3 方法 參照文獻(xiàn)[6，7]采用高壓水尾靜脈注射法將既往構(gòu)建的siRNA表達(dá)載體按5 mg/kg給藥，按小鼠體重的8%注入，均以PBS(1.5～2.0 ml)稀釋，10 s左右注射完成。在注射后6 d、21 d、1個月、3個月、6個月、9個月通過小鼠內(nèi)眥靜脈采血，使用上述方法檢測HBsAg(U/ml)濃度和HBV-DNA定量拷貝數(shù)，計(jì)算出 HBsAg的抑制率，抑制率= (NPBS對照組－N實(shí)驗(yàn)組)/NPBS對照組×100%。

2 結(jié)果

2.1 不同載體長期作用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠對HBsAg濃度的影響 siRNA載體轉(zhuǎn)染HBV轉(zhuǎn)基因小鼠后，在治療6 d、21 d、1 月、3 月、6 月、9 月采血檢測小鼠血清中的HBsAg濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在治療的第6天特異性siRNA組與PBS對照組相比HBsAg濃度顯著

降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，至第21天時基本穩(wěn)定于一較低水平表達(dá)，直到觀測的第9個月HBsAg濃度無明顯改變;而陰性對照組對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠HBsAg水平無任何抑制作用。同時研究發(fā)現(xiàn)特異性siRNA組抑制效應(yīng)在pSilencer5.1/C2載體最為明顯，pSilencer5.1/C2、pSilencer4.1/C2、pSilencer 3.1/C2對HBsAg的抑制效率在9個月時分別為 (92.80 ±0.93)%、(90.02 ± 0.92)%、(85.62 ±0.88)%，見表1。

2.2 轉(zhuǎn)染了siRNA載體的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清的HBV-DNA水平 對轉(zhuǎn)染了siRNA載體的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠在治療后上述同樣時間采血檢測小鼠血清中的HBV-DNA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在治療的第6天特異性siRNA組與PBS對照組相比HBV-DNA濃度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而陰性對照組對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠HBV-DNA水平無任何抑制作用。其中在特異性siRNA組中，以pSilencer5.1/ C2載體對HBV-DNA的抑制最顯著，其次pSilencer4.1/C2 稍強(qiáng)于 pSilencer3.1/C2，見圖 1。

圖1 不同載體長期作用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清中HBVDNA濃度Fig.1 Long-term-siRNA treatment with HBV transgene mice HBV-DNA serum concentration

表1 不同載體長期作用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清中HBsAg濃度(U/ml，n=10)Tab.1 Long-term-siRNA treatment with HBV transgene mice of HBsAg serum concentration(U/ml，n=10)

3 討論

RNAi是保守的進(jìn)化機(jī)制，有利于對抗外來基因的入侵如病毒和轉(zhuǎn)座子等，是基因水平的抗病毒免疫機(jī)制，同時還參與自身基因表達(dá)的調(diào)控[8，9]。小非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)是一類內(nèi)源性、約21-25 nt長的 miRNAs(microRNA)或siRNAs，具有穩(wěn)定的特異性序列以調(diào)節(jié)基因表達(dá)。這些RNA分子雖然很小，卻在基因表達(dá)的調(diào)控中扮演了重要的角色。目前在真核細(xì)胞內(nèi)，siRNA的來源主要有兩種:一種是化學(xué)合成的 siRNA，操作簡單，但作用時間短、成本昂貴;另一種是構(gòu)建 siRNA表達(dá)質(zhì)粒，它可以在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成短的發(fā)夾狀 shRNA，可以產(chǎn)生與化學(xué)合成的siRNA同樣的沉默效應(yīng)，并且作用持久。siRNA不僅是一種研究基因功能的有力工具，而且在抗病毒復(fù)制方面具有很高的藥物開發(fā)價(jià)值[10，11]。

本實(shí)驗(yàn)表明在特異性siRNA長期作用下HBV轉(zhuǎn)基因小鼠HBsAg濃度和乙肝病毒復(fù)制均被有效抑制，且與對照組有顯著性差異(P＜0.05)，其中pSilencer5.1/C2對病毒的抑制效率最高，因?yàn)閜Silencer5.1/C2載體是一種基于逆轉(zhuǎn)錄病毒和聚合酶Ⅲ的雙啟動子表達(dá)載體，它既可以經(jīng)反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系統(tǒng)達(dá)到siRNA的傳輸，也可以由聚合酶Ⅲ啟動子介導(dǎo)高水平的siRNA傳輸。pSilencer4.1/C2較高于pSilencer3.1/C2，這與不同載體的驅(qū)動子類型密切相關(guān)，pSilencer4.1/C2基于 Pol II的表達(dá)載體，pSilencer3.1/C2載體是基于聚合酶Ⅲ，研究發(fā)現(xiàn)PolⅡ可能在真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起非常重要的作用，能夠介導(dǎo)有效的 siRNA合成和較強(qiáng)的RNAi效應(yīng)，尤其對在體水平的調(diào)控，它可能主要負(fù)責(zé)體內(nèi)mRNA轉(zhuǎn)錄。PolⅡ啟動子所驅(qū)動的siRNA表達(dá)同樣可以與PolⅢ啟動子驅(qū)動的siRNA表達(dá)相當(dāng)，且不會引起非靶向效應(yīng)的產(chǎn)生[12]。因此從長期抑制效果來看 pSilencer5.1/C2較 pSilencer4.1/C2和pSilencer3.1/C2來說是較為理想的抑制載體。

總之，特異性siRNA可以有效的抑制HBV的復(fù)制和表達(dá)，但siRNA對已存在的HBVCCCDNA沒有作用[13]，徹底清除 HBV尚有一定的困難，因此，加強(qiáng)病毒性肝炎的預(yù)防及探求慢性肝炎的有效治療方法，仍是當(dāng)前亟待解決的重大課題。

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[收稿2013-10-10 修回2013-11-18]

(編輯 倪 鵬)

Evaluation of long-term-siRNA treatment with HBV transgene mice on inhibit replication of hepatitis B virus

ZHANG Wei-Yun，SUN Zhao-Hui，REN Guang-Li，SHI Yu-Ling，LI Wei，ZANG Rong，TANG Rong-Zhi.Department of Clinical Laboratory，General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA，Guangzhou 510010，China

Objective:To investigation of the long-term-siRNA treatment with HBV transgene mice on inhibit replication of hepatitis B virus.MethodsThe constructed siRNA expressed vectors was transfected HBV transgene mice by hydrodynamics-based injection via vena caudalis.Different groups were set including:specificity siRNA groups(pSilencer5.1/C2，pSilencer4.1/C2，pSilencer3.1/C2)，PBS group and negative vector group(n=10).The effect was observed in different periods(6 d，21 d，1 months，3 months，6 months and 9 months after injection).HBsAg was analyzed by Chemiluminescence method，HBV-DNA was analyzed by real time quantitative PCR(RQ-PCR).ResultsCompared with the PBS group，specificity siRNA groups showed decreased levels of HBsAg and HBV-DNA(P ＜0.05).Negative vector group did not show such changes，there were no significant differences(P ＞0.05).ConclusionThe siRNA based on the expression vector can suppress the expression and replication of HBV in HBV transgene mice.The inhibition effects of long-term-siRNA treatment was specific.

siRNA;HBV transgene mice;Hepatitis B virus

R392.7

A

1000-484X(2014)05-0666-03

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.021

①本文為廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(A2012444)。

②廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院兒科，廣州510010。

張衛(wèi)云(1978年－)，女，主管技師，主要從事臨床免疫學(xué)方面研究，E-mail:1261349825@qq.com。